UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL ESTUDO DA RESPOSTA PERITONIAIS SISTÊMICA E AGUDA, DA DE FORMAÇÃO COLÁGENO DE AO ADERÊNCIAS DA PRODUÇÃO IMPLANTE DO COMPÓSITO TELA DE POLIPROPILENO-FILME À BASE DE QUITOSANA EM SUÍNOS Apóstolo Ferreira Martins Orientadora: Profa. Dra. Neusa Margarida Paulo Goiânia 2013 ii iii APÓSTOLO FERREIRA MARTINS ESTUDO DA RESPOSTA PERITONIAIS SISTÊMICA E AGUDA, DA DE FORMAÇÃO COLÁGENO DE AO ADERÊNCIAS DA PRODUÇÃO IMPLANTE DO COMPÓSITO TELA DE POLIPROPILENO-FILME À BASE DE QUITOSANA EM SUÍNOS Tese apresentada à Escola de Veterinária e Zootecnia como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal. Área de concentração: Patologia, Clínica e Cirurgia Animal Linha de Pesquisa: Técnicas cirúrgicas e anestésicas, patologia, clínica cirúrgica e cirurgia experimental Orientadora: Dra. Neusa Margarida Paulo Comitê de Orientação: Profa. Dra. Naida Cristina Borges – EV/UFG Prof. Dr. Renato Miranda de Melo – FM/UFG Goiânia 2013 iv v vi Dedico esse trabalho a Deus, à minha minhas Marianna esposa filhas e Geracina, Maria aos Rosa às e meus Pais Apóstolo e Marlene. vii AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a DEUS, o verdadeiro arquiteto de todas as coisas, que permitiu essa realização. Muitas vezes notamos a sua presença quando ele coloca pessoas para somar nas nossas vidas. Meus sinceros agradecimentos à todos. À minha família, que me acompanhou em todos os momentos durante essa caminhada. À minha amiga e orientadora professora Neusa Margarida Paulo, que de forma incansável, me estimulou e ajudou na realização desse projeto. Aos meus amigos professores Naida Cristina Borges e Renato Miranda de Melo, do que posso falar com certeza, meu verdadeiro comitê de orientação, pela dedicação e presteza que sempre me atenderam. À professora Ângela Maria Moraes, que gentilmente nos cedeu o compósito para que pudéssemos desenvolver esse trabalho, e pela disponibilidade em ajudar na finalização do mesmo participando da defesa. Aos engenheiros químicos Walter Anibal Rammazzina Filho e Ana Kelly Girata, pela confecção do compósito usado e gentileza em nos atender. À minha amiga, professora Liliana Borges de Menezes, pela inestimável ajuda na área de patologia. Ao amigo José Belarmino da Gama-Filho, que não mediu esforços para se deslocar a Goiânia quando precisei do seu auxilio. Aos meus incansáveis amigos na lida com os animais em todos os momentos. Sarah Barbosa Martins, Ângela Moni Fonseca, Késia Sousa Santos, Prìscila Vaz Coutinho, Aline Rodrigues Lemes, Rayssa Kossa Barbosa, Ashbel Schneider da Silva, Allyne Nayhara de Sá Moreira Pinho, Victor Araújo Arruda, Gabriela Haver Gabriel, Lorena Souza Oliveira, Sandro de Melo Braga, Mariana Moreira Andrascko, Danilo Ferreira Rodrigues, Natália Bragatto, Ana Paula Araújo Costa. Sem vocês não esse trabalho não chegaria ao fim desejado. Aos amigos e professores Luiz Antônio Franco da Silva, Juan Carlos Duque Moreno, Adilson Donizeti Damasceno, Paulo Henrique Jorge da Cunha viii que se prontificaram em ajudar a lapidar esse trabalho participando da qualificação. Aos professores Eurípedes Laurindo Lopes e Romão da Cunha Nunes, por ajudar na disponibilização dos suínos. Aos amigos Antônio de Castro Rezende e Wesley Francisco Neves, pela torcida ajuda e apoio para essa realização. Aos amigos Sheila de Almeida de Souza, Vilda Maria dos Reis, João Vilela Teixeira e Edvalson Vierira da Costa, pelo apoio na preparação dos materiais e organização durante o experimento. À todos os professores, funcionários e colegas de curso do programa de pós-graduação da EVZ. À todos os funcionários do Hospital Veterinário. Ao Povo brasileiro com pagamento de impostos, propiciaram a minha formação nas suas instituições públicas. À Universidade Federal de Goiás e Escola de Veterinária e Zootecnia que me acolheram como estudante e profissional. Ao Hospital Veterinário, que acompanho dia a dia, e sinto como minha segunda casa. À empresa Boiforte no nome do amigo Carlos Henrique Barbosa pelo apoio. Aos animais de pesquisas que permitem a evolução da medicina e ajuda na cura dos males do homem e de todos os animais. ix “Ando devagar porque já tive pressa e levo esse sorriso porque já chorei demais Hoje me sinto mais forte, mais feliz, quem sabe só levo a certeza de que muito pouco sei ou nada sei.” Almir Sater & Renato Teixeira x SUMÁRIO LISTAS DE FIGURAS .............................................................................................................XII LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... XV LISTA DE QUADROS ........................................................................................................... XVI LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................. XVII RESUMO................................................................................................................................. XVIII ABSTRACT ............................................................................................................................... XIX CAPITULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS ..................................................................... 1 1 ASPECTOS GERAIS DO PERITÔNIO ............................................................................. 2 2 ADERÊNCIAS PERITONIAIS .............................................................................................. 3 3 TELAS DE POLIPROPILENO.............................................................................................. 5 4 QUITINA/QUITOSANA ........................................................................................................... 6 5 ULTRASSONOGRAFIA ......................................................................................................... 7 6 VIDEOLAPAROSCOPIA ....................................................................................................... 7 REFERÊNCIAS............................................................................................................................. 8 CAPÍTULO 2 – RESPOSTA SISTÊMICA AGUDA AO IMPLANTE INTRAPERITONIAL DO COMPÓSITO TELA DE POLIPROPILENO-FILME À BASE DE QUITOSANA EM SUÍNOS ................................................................................ 13 RESUMO...................................................................................................................................... 13 ABSTRACT ................................................................................................................................. 14 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 15 xi MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 16 RESULTADOS ........................................................................................................................... 20 DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 22 CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 25 REFERÊNCIAS.......................................................................................................................... 25 CAPÍTULO 3 - ADERÊNCIAS E REAÇÕES TECIDUAIS APÓS IMPLANTE INTRAPERITONIAL DO COMPÓSITO POLIPROPILENO-FILME À BASE DE QUITOSANA E DA TELA DE POLIPROPILENO, NA PAREDE ABDOMINAL DE SUÍNOS ........................................................................................................................................ 28 RESUMO...................................................................................................................................... 28 ABSTRACT ................................................................................................................................. 29 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 30 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 32 RESULTADOS ........................................................................................................................... 40 DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 47 CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 50 REFERÊNCIAS.......................................................................................................................... 51 CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................... 57 ANEXOS ...................................................................................................................................... 58 xii LISTAS DE FIGURAS Capítulo 2 Figura 1 - (A) Tela cirúrgica de polipropileno. (B) Compósito tela de polipropilenofilme à base de quitosana.....................................................................................17 FIGURA 2 – Tela cirúrgica de polipropileno implantada intraperitonialmente corrigindo defeito induzido experimentalmente na parede abdominal de suíno......................................................................................................................19 Capítulo 3 FIGURA 1 – (A) Tela de polipropileno. (B) Compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana.................................................................................................33 FIGURA 2 - Região cirúrgica após secção da pele, tecido subcutâneo e músculo oblíquo abdominal externo com visualização da bainha externa do musculo reto abdominal em suíno (A); Excisão de fragmento do músculo transverso do abdome com visualização e exposição do peritônio parietal (B); Implante da tela após incisão do peritônio com sutura contínua simples (C e D) ...............................................................................................................................34 FIGURA 3 – Sonograma transversal da parede abdominal de suíno em que se identifica a linha alba (seta) e a equivalência à direita e à esquerda das camadas musculares; músculo oblíquo externo do abdome (OE); músculo reto do abdome (R); músculo transverso do abdome (T). No detalhe, transdutor posicionado sobre a linha média.........................................................................................................36 xiii FIGURA 4 - Indicação dos três pontos de inserção de instrumental para videolaparoscopia em suíno; (1) ponto de inserção da agulha de Veress; (2) ponto de inserção do telescópio com ótica de 30º; (3) ponto para inserção da pinça laparoscópica auxiliar; sítio do implante do biomaterial (setas vermelhas); no detalhe, posicionamento da cânula de 5 mm e do telescópio, cavidade peritonial insuflada e parede abdominal transiluminada. .....................................37 FIGURA 5 - Microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos biomaterias tela de polipropileno de alta gramatura (A) x35 e (B) x55; compósito tela de polipropilenofilme à base de quitosana (C) x37 e (D) x140. Monofilamento de polipropileno (PP) e filme à base de quitosana (Q) ...................................................................40 FIGURA 6 – Sonograma (12 MHz) em corte transversal da parede abdominal íntegra de suíno na região selecionada para o implante do biomaterial. Observase músculo oblíquo externo do abdome (OE), músculo Reto do abdome (R), músculo Transverso do abdome (T). ....................................................................42 FIGURA 7 - Sonograma (12 MHz) em corte transversal da parede abdominal de suíno para identificação do compósito e tela implantados. Região sobre os biomateriais com tecido em organização. (A) Formato ondulado do compósito; à direita, profundidade em cm da pele ao compósito. (B) Formato linear do compósito; em detalhe, transdutor posicionado sobre a cicatriz da ferida cirúrgica. (C) Presença do fígado aderido à tela de polipropileno (seta branca grossa); a seta fina mostra a sutura de fixação da tela. (D) Região hipoecóica sob o compósito (seta branca); vesícula biliar (VB)........................................................42 FIGURA 8 - Escores aplicados na avaliação das imagens obtidas durante exames de videolaparoscopia; escore 0 = ausência de aderências; escore 1 = aderência de omento; escore 2 = aderência de fígado; escore 3 = aderência de fígado e omento....................................................................................................43 xiv FIGURA 9 –. Fotomicrografias de fragmentos do tecido da parede abdominal de suíno integrada aos monofilamentos da tela de polipropileno 28 dias após o implante (HE, 200X e 400X). Tecido conjuntivo frouxo (TCF). Células gigantes de corpo estranho (setas). Infiltrado mononuclear (MN). Região ocupada pelo monofilamento da tela (PP)...................................................................................46 FIGURA 10 – Fotomicrografias de fragmentos do tecido da parede abdominal de suíno aos 28 dias após a implantação do compósito (Coloração HE). (A) 100X, (B) 200X e (C e D) 400X. Tecido conjuntivo frouxo (TCF). Infiltrado Polimorfonuclear (PMN). Lacuna ocupada pelo compósito (LOC). Fragmentos do filme de quitosana (Q)...........................................................................................46 FIGURA 11 - Fotomicrografias de tecidos dos grupos PQ e PP aos 28 dias após a implantação dos biomateriais sobre luz polarizada. Coloração picrossírius com aumento de 50X. A) Lâmina do grupo PQ. B) Lâmina do grupo PP. (Q) Fragmentos do filme de quitosana. (PP) monofilamentos da tela de polipropileno. (INF) Infiltrado inflamatório. (COL) Colágeno. .....................................................47 xv LISTA DE TABELAS Capítulo 2 TABELA 1 – Contagem média dos elementos celulares sanguíneos avaliados no grupo PP e PQ, 24 horas antes da cirurgia (M0), aos dois e sete dias após a cirurgia (M2, M7). Goiânia, 2013...........................................................................21 TABELA 2 – Dosagem em valores médios de proteínas sanguíneas avaliadas no grupo PP e PQ, 24 horas antes da cirurgia (M0), aos dois e sete dias após a cirurgia (M2, M7). Goiânia, 2013...........................................................................22 Capítulo 3 TABELA 1 - Média de peso dos suínos, realizados no grupo PP e PQ no início do experimento (M0) e 28 dias após no final (M28). Goiânia, 2013. ........................41 – TABELA 2 Resultados da comparação de escores para avaliação videolaparoscópica das aderências no grupo PP e PQ, aos 28 dias após o implante intraperitonial do compósito polipropileno-filme à base de quitosana e da tela de polipropileno. Goiânia, 2013......................................................................44 TABELA 3 – Resultado da comparação de escores para determinação do grau de inflamação provocado pelo implante do biomaterial nos grupos polipropileno (PP) e compósito polipropileno-filme à base de quitosana PQ em suínos. Goiânia, 2013.......................................................................................................................44 TABELA 4 - Resultado da comparação de escores para avaliação da qualidade do colágeno, realizada no grupo PP e PQ, aos 28 dias após implante intraperitonial do compósito polipropileno-filme à base de quitosana e da tela de polipropileno Goiânia, 2013...................................................................................45 xvi LISTA DE QUADROS Capítulo 3 QUADRO 1 - Escores para classificação das aderências peritoneais em suínos, com escala de pontuação para extensão e gravidade das aderências. Goiânia, 2013.......................................................................................................................38 QUADRO 2 – Escores para determinação do grau de inflamação provocado pelo implante do compósito polipropileno-filme à base de quitosana e da tela de polipropileno, em suínos. Goiânia, 2013. .............................................................39 QUADRO 3 - Escores para avaliação do colágeno na região do implante junto ao compósito polipropileno-filme à base de quitosana e da tela de polipropileno, em suínos. Goiânia, 2013...........................................................................................39 xvii LISTA DE ABREVIATURAS COEP C3a e C5a EDTA PDGF IGF-1 TNF-α TGF-β Ig M IFN-γ IL-1, 2, 4, 5, 6, 9, 10 e 13 Th1, Th2 MEC MPA mg mg/kg mL mm mmHg M2 M7 M0 PMN PP PQ PCR MCP-1 kg 2QM UI Comitê de Ética em Pesquisa da UFG Complemento Etilenodiaminotetracético Fator de crescimento plaquetário Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 Fator de necrose tumoral alfa Fatores de crescimento transformante beta Imunoglobulinas M Interferon gama Interleucinas Linfócitos T helper 1 e 2 Matriz extracelular Medicação pré-anestésica Miligramas Miligramas por quilograma de peso corporal Mililitros Milímetros Milímetros de mercúrio Momento 1 Momento 2 Momento inicial Polimorfonucleares Polipropileno Polipropileno-Quitosana Proteína C-reativa Proteína quimiotáxica de monócitos tipo 1 Quilogramas Solução de quitosana com dobro de massa molar Unidades internacionais xviii RESUMO Defeitos de parede abdominal podem requerer a reconstrução anatômica e funcional, o que normalmente é conseguido com emprego de telas. Entretanto, esses materiais podem desencadear a formação de aderências. Para minimizar, ou impedir, esse processo uma das faces da tela pode ser revestida por um produto que se interponha entre este material e o peritônio visceral. O presente estudo avaliou a resposta sistêmica e tecidual ao implante do compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana 2QM (grupo PQ), comparado à promovida pela tela de polipropileno isolada (grupo PP), implantada intraperitonialmente na cavidade abdominal de suínos. Após 28 dias procedeu-se a avaliação por ultrassonografia, videolaparoscopia e não se observou diferença significativa entre os dois grupos de animais com relação à formação de aderências (P > 0,05). As reações sistêmicas foram avaliadas por meio da contagem de leucócitos, dosagem de proteína C-reativa, proteínas totais séricas, albumina e globulinas, que também não mostraram diferença significativa entre os grupos (P1 > 0,05). A resposta sistêmica ao compósito foi proporcional à resposta promovida pela tela de polipropileno. Entretanto, a resposta inflamatória tecidual foi maior no grupo PP (P = 0,0033). Os polimorfonucleares apresentaram-se estatisticamente aumentados na região do implante no grupo PQ (P = 0,0068). O colágeno tipo I e o colágeno total predominaram nas regiões de implante do grupo PP ( P = 0,0154 e P = 0,0037 respectivamente). Concluiu-se que o compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana não promoveu resposta sistêmica nos animais, mas a resposta inflamatória tecidual foi representada por um influxo tardio de polimornucleares. Pode-se inferir que a elevada espessura do filme à base de quitosana e seu longo tempo de degradação in vivo (>28 dias) foram fatores que dificultaram a incorporação do compósito no tecido receptor. Palavras-chave: Laparoscopia. Quitosana, Peritônio, Colágeno, Ultrassonografia, xix ABSTRACT Abdominal wall defects may require anatomical and functional reconstruction, what is usually achieved with the use of meshes. However these materials can trigger the formation of adhesions. To minimize or abolish this process one side of the mesh can be coated with a product that stands between this material and the visceral peritoneum forming a composite. The present study evaluated the systemic and tissue response to the implantation of composite polypropylene mesh-based film of chitosan 2QM (PQ group), compared to promoted by polypropylene mesh alone (group PP), intraperitoneally implanted in the abdominal cavity of pigs. After 28 days evaluation was performed by ultrasonography and video-laparoscopy. No significant difference was observed between the two groups of animals with respect to the formation of adhesions (P> 0.05). Systemic reactions were evaluated by means of the leukocyte count, Creactive protein dosage, seric total protein, albumin and globulins which also showed no significant difference between groups (P1> 0.05). The systemic response was proportional to the composite response promoted by polypropylene mesh. However, the tissue inflammatory response was higher in the PP group ( P = 0.0033). The number of polymorphonuclear cells increased statistically in the region of the implant in PQ group (P = 0.0068). Type I collagen and total collagen predominated in the implant regions in PP group (P = 0.0154 and P = 0.0037 respectively). It was concluded that the composite polypropylene mesh-chitosan based film has not promoted systemic response in animals, but the tissue inflammatory response was represented by a slow influx of polimornucleares. It can be inferred that the thickness of the chitosan based film was a factor that hindered the incorporation the composite by tissue receptor along with the slow degradation of the polysaccharide in vivo. Keywords: Chitosan, Peritoneum, Collagen, Ultrasonography, Laparoscopy. CAPITULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS Defeitos da parede abdominal nas diferentes espécies devem ser corrigidos preferencialmente por meio da aproximação dos planos lesados, entretanto, esta abordagem pode, dependendo da quantidade de tecido incluído nos planos de síntese, promover hipertensão abdominal e tensão sobre as linhas de sutura (MELO, 2011). Nesses casos há necessidade de utilização de telas sem distorção excessiva da anatomia normal (LICHTENSTEIN et al., 1989). As telas cirúrgicas comumente utilizadas para reconstrução da parede abdominal, apesar de ser largamente aceitas pela comunidade cirúrgica, não são isentas da promoção de alterações teciduais, e a resolução deste problema tem sido alvo de estudos que visa projetar, controlar e direcionar suas propriedades para uma resposta biológica específica e modulada (MITRAGOTRI & LAHANN, 2009). Todo material usado para substituir ou restaurar uma função do organismo, ficando continuamente ou intermitentemente em contato com os fluidos corpóreos, é considerado um biomaterial. Deve ser biocompatível, não despertar respostas adversas nos tecidos, nem sofrer desgastes significativos decorrentes desta interação. Adicionalmente, esses materiais não podem ser tóxicos nem carcinogênicos e suas propriedades físicas e mecânicas deverão ser compatíveis com as dos tecidos onde serão implantados (AGRAWAL, 1998). Biomateriais derivados de elementos naturais ocupam um lugar de destaque nas pesquisas biomédicas, já que muitos têm atendido as exigências necessárias para seu bom desempenho in vivo (LANGER & TIRRELL, 2004). Neste sentido, pesquisas vêm sendo conduzidas para elaboração de materiais que possam atender às condições necessárias para sua implantação na cavidade peritonial (MARTÍN-CARTES et al., 2006). As próteses, quando implantadas na parede abdominal, normalmente despertam uma reação inflamatória previsível que evolui para uma fibrose, o que auxilia na sua incorporação aos tecidos subjacentes. A implantação das próteses promove então, um suporte mecânico para a parede e permite a formação de um neoperitônio sobre o material (BELLÓN et al., 2001). Para minimizar ou impedir a formação de aderências ao implante intraperitonial de telas de polipropileno, uma 2 das faces da tela pode ser revestida por um produto entre a mesma e o peritônio visceral. Estes materiais, formados pela associação da tela a outro biopolímero, são conhecidos como compósitos. A camada adicional atuará então como sistema de barreira, combinando a força da tela com a ação anti-adesiva do revestimento (BELLÓN et al., 2001; ZHOU et al. 2007). Tendo em vista a relevante importância dos biomateriais, das alterações nos tecidos biológicos e das reações sistêmicas, elaborou-se esse estudo tendo como material a quitosana que vem revelando-se promissora nas pesquisas biomédicas. Portanto, os objetivos desse trabalho foram avaliar as reações sistêmicas agudas e teciduais, bem como, a ocorrência e a extensão de aderências induzidas pelo compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana, implantado intraperitonialmente em suínos. Para tanto, foram analisados os resultados das análises laboratoriais de proteínas C-reativa, proteínas totais séricas, dosagem de albumina e globulinas e o leucograma; respostas clínicas pós-implante dos biomateriais; a ultrassonografia no diagnóstico das reações teciduais e aderências peritoniais; as imagens videolaparoscopicas da cavidade peritoneal e as reações teciduais induzidas e avaliadas por meio de microscopia óptica. 1 Aspectos gerais do peritônio O peritônio é uma membrana originada do mesoderma embrionário e reveste toda a cavidade abdominal e parte da cavidade pélvica (CROWE & BJORLING, 1998). É recoberto pelo mesotélio, que se desenvolve entre oito e dezoito dias de gestação, dependendo da espécie, diferenciando-se de células cuboides para células alongadas e achatadas presentes ao longo da cavidade celômica (MUTSAERS, 2002). Esta membrana é a maior serosa do corpo, com uma área de superfície equivalente à da pele. É responsável pela secreção do fluido peritonial e proteção visceral. Estruturalmente, o peritônio é constituído por uma monocamada celular mesotelial, que repousa sobre uma membrana basal formada por matriz extracelular (MEC), na qual, estão presentes os vasos sanguíneos e linfáticos. As células mesoteliais possuem núcleos grandes, 3 proeminentes e ocupam quase todo citoplasma (CHEONG et al., 2001; DURON, 2004; VAN DER WALT & JEEKEL, 2007). A parede abdominal é recoberta pelo folheto parietal, contudo, os órgãos abdominais e parte dos pélvicos são revestidos pelo folheto visceral do peritônio. O espaço formado entre os dois folhetos constitui a cavidade peritonial. A inervação do peritônio parietal é constituída pelos nervos espinhais, intercostais e lombares. Os nervos frênicos inervam a lâmina diafragmática, e o nervo obturador o restante do folheto parietal. A vascularização do peritônio parietal é representada pelos vasos oriundos da parede abdominal e também pela artéria e veia mesentérica (CROWE & BJORLING, 1998). O peritônio é considerado um componente importante do sistema imune. Para se defender de agressões de diversas naturezas, como por exemplo, a manipulação cirúrgica, com ou sem implante de um material. Essa membrana responde por meio de quatro mecanismos: bomba diafragmática (MUTSAERS, 2002; DURON, 2004; SAMMOUR et al., 2010), sistema imune inato (BROKELMAN et al., 2011), sistema imune específico e formação de abscesso (SAMMOUR et al., 2010). 2 Aderências peritoniais As aderências peritoniais são conhecidas há, pelo menos, 1500 anos. Foram referenciadas em 440 d.C., no entanto, existem indícios de que os antigos egípcios, conhecidos pelos seus relatos detalhados de anatomia humana, já haviam descrito a presença de aderências pélvicas alguns séculos antes (WERNER et al., 2009). Estima-se que na espécie humana as aderências peritoniais sejam responsáveis por 75% das obstruções do intestino delgado, e podem levar a um risco de mortalidade de 10% nas complicações mais graves, quando não diagnosticadas e tratadas rapidamente (SAMMOUR et al., 2010). Segundo SHAIN et al. (2007), após procedimentos cirúrgicos abdominais, cerca de 3 a 8% dos pacientes, em determinado momento da vida, apresentarão obstrução mecânica intestinal. A abertura cirúrgica da cavidade abdominal em procedimentos gerais urológicos e ginecológicos pode provocar aderências em 95% dos pacientes. 4 Estas complicações são consideradas as causas mais importantes de dor abdominal crônica, obstrução intestinal e infertilidade (DURON, 2007). Os custos do seu diagnóstico e tratamento são elevados (DUBCENCO et al., 2009). Considerando os riscos de mortalidade, justifica-se a busca constante por mecanismos e materiais que previnam a formação das aderências (SAMMOUR et al., 2010). Embora existam várias descrições relativas às aderências peritoniais na espécie humana, o mesmo não ocorre com relação as diferentes espécies animais, com exceção dos equinos e dos animais de laboratório. Na espécie equina, quando são realizados procedimentos cirúrgicos do intestino delgado, o índice de aderências peritoniais pode variar de 14% a 22%, sendo esta a causa mais comum de dor recorrente, e a segunda causa de celiotomias repetidas. Ao incluir todas as cirurgias abdominais nessa espécie, a incidência de aderências está próxima de 5% (WERNER et al., 2009). Porém, a verdadeira prevalência nessa espécie ainda é desconhecida (CALDWELL & MUELLER, 2010). Independentemente da espécie abordada, as aderências são o resultado de um desequilíbrio entre os processos de fibrinogênese e fibrinólise (SULAIMAN et al., 2002). As lesões da membrana peritonial estão frequentemente relacionadas às alterações estruturais do mesotélio, o que pode às vezes, resultar no impedimento do processo de reparo peritonial normal. As reações inflamatórias, isquemia tecidual, infecções, reações a corpos estranhos, dentre outros, podem levar a maior liberação de citocinas, o que, associadas ao atrito entre as vísceras, facilitam ainda mais a perda da cobertura mesotelial (BITTINGER et al. 1999; STADLMAN et al., 2006). O resultado são os processos mórbidos citados anteriormente. Para RIESE et al. (2004), as células mesoteliais em homeostase apresentam uma taxa de mitose geralmente constante, próxima de 0,5%. Quando o peritônio é lesado, essa porcentagem aumenta para 30% e pode chegar a 60%. As células mesoteliais são estimuladas pelo aumento dos níveis de fatores de crescimento, que possuem papel importante na recuperação peritonial (VAN DER WALT & JEEKEL, 2007). Todos os mediadores químicos originados por elementos celulares, no sitio da lesão e presentes no fluido peritoneal, apresentam um papel importante na recuperação do peritônio após o trauma (KAMEL, 2010). O fator de 5 crescimento transformante β (TGF β) também é um representante desses fatores. É capaz de regular a resposta de outras células e estimular os fibroblastos a sintetizarem proteínas como o colágeno, fibronectina e integrinas. Em contrapartida, provoca a diminuição da produção de colagenases e heparinases, cuja função é degradar a matriz extracelular, promovendo acúmulo de tecido conjuntivo no local da lesão. O TGF β também é considerado um estimulador da formação de aderências peritoniais (BROKELMAN et al., 2011). Na presença de um trauma, o peritônio sofre um aumento da permeabilidade capilar mediado por histamina, com exsudação inflamatória e deposição de fibrina. As células polimorfonucleares (PMN) são as primeiras a aparecer no local da lesão e permanecem por um a dois dias em níveis elevados. A migração dos monócitos através da monocamada mesotelial ao sítio da lesão, é mais tardia, eles aderem à superfície e se diferenciam em macrófagos. Após três dias começam a ser recobertos pelo mesotélio, e ficam então, mais profundos. Normalmente, a matriz de fibrina interconecta as duas membranas peritoniais. A atividade fibrinolítica é suprimida e como resultado, ocorre à persistência de feixes de fibrina posteriormente infiltrados por fibroblastos, que, organizarão as aderências identificáveis clinicamente (CHEONG et al., 2001; DIZEREGA & CAMPEAU, 2001). 3 Telas de polipropileno A tela de polipropileno é considerada um biomaterial clássico para reconstrução da parede abdominal, mas vem sofrendo modificações com o objetivo de aprimorar o seu arranjo espacial, especialmente no que se refere ao tamanho dos seus poros, e, consequentemente, reduzir a reação de corpo estranho e a posterior formação de fibrose. Dessa maneira, se possibilitaria maior conforto, melhor flexibilidade e mobilidade da parede abdominal (BELLÓN et al., 2007). A reestruturação espacial das telas se iniciou com o desenvolvimento em 1998 de telas com grandes poros, estabelecendo-se o conceito de telas de baixa gramatura, que possuem poros maior que 1mm, reduzindo assim as complicações clínicas decorrentes do processo inflamatório (JUNGE et al., 2012). 6 Sabendo-se que o desenvolvimento das aderências é decorrente também do atrito entre superfícies peritoniais lesadas, nas quais há deposição de fibrina que culmina na união destas superfícies, tem-se proposto a colocação de um material degradável ou não degradável entre estas. É conhecido como sistema de barreiras (BELLÓN et al., 2005). Telas com dupla camada também tem sido desenvolvidas para inibir a formação de aderências viscerais às telas, quando estas são posicionadas intraperitonialmente (MUYSOMS et al., 2011). A divulgação do uso das telas cirúrgicas foi estimulada pelas publicações de Usher (1958) e 30 anos depois pela popularização do seu uso por Lichtenstein. A reparação dos defeitos de parede abdominal com a utilização de telas tornou-se então padrão na maioria dos países, é amplamente aceita como superior em comparação com a reparação realizada por meio de sutura primária. O resultado desse fato é que tem ocorrido um rápido aumento da variedade de telas disponíveis no mercado (BROWN & FINCH, 2010). O objetivo principal da implantação de telas na parede abdominal é promover um reforço desta, e reduzir os riscos de recidiva do processo original. 4 Quitina/Quitosana Em 1811, o francês Henri Braconnot estudando cogumelos descobriu um polímero que recebeu o nome de fungina, que mais tarde foi chamada de quitina, quando Odier em 1823 conseguiu isolá-la do exoesqueleto de insetos. Em 1859, Rouget colocou a quitina em ebulição com hidróxido de potássio, desacetilando-a e, dessa forma, sintetizou a quitosana. A quitina pode ser encontrada em fontes naturais e abundantes como os crustáceos, insetos algas verdes, leveduras e fungos (CRAVEIRO et al., 1999). A quitina é a segunda fibra mais abundante na natureza e sua estrutura química é semelhante à da celulose (LAN et al., 2011). A quitina e a quitosana são materiais pesquisados com muita frequência na Ásia, desde os anos 60. O principal objetivo dos estudos é melhor entender essas fibras quanto aos seus métodos de produção, purificação e sua química de derivações e aplicações (KHOR & LIM, 2003). A quitosana, por definição, é um mucopolissacarídeo N-desacetilado derivado da quitina. Tem sido 7 considerada como uma fibra natural com alto potencial de aproveitamento biomédico devido a sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e não toxicidade, diferentemente dos polímeros de origem sintética, que apresentam propriedades limitadas, por isso, a importância das pesquisas relacionadas a este biomaterial (KUMAR, 2000; LAN et al., 2011). 5 Ultrassonografia A determinação da topografia dos músculos e bainhas que compõem a parede abdominal, para fins de localização de pontos ideais destinados para anestesia loco-regional, é realizada frequentemente por meio do exame de ultrassonografia em seres humanos (MOKINI et al. 2011; HERRING et al. 2012). Esse exame também é bastante usado na rotina cirúrgica com o intuito de avaliar as estruturas da parede abdominal, bem como, a ocorrência de aderências pré e pós-cirúrgicas na cavidade peritonial (SIGEL et al., 1991). Os defeitos de parede abdominal, corrigidos com telas e avaliados pela ultrassonografia, podem fornecer informações importantes sobre o delineamento anatômico desse material, após o implante, e possíveis complicações esperadas da sua utilização. Esse fato propicia ao cirurgião uma melhor avaliação pós-operatória e uma decisão mais rápida em caso de necessidade de nova intervenção (JAMADAR et al., 2008). 6 Videolaparoscopia Na Medicina Veterinária, a laparoscopia exploratória é realizada quando os resultados podem evitar a laparotomia desnecessária ou mudar o curso do tratamento de enfermidades, que acometem a cavidade peritonial. Um dos benefícios principais dessa técnica é a visibilização de alterações dos tecidos, o que ajuda no diagnóstico de doenças insuspeitas da cavidade peritonial por outros exames (FREEMAN, 2009). Essa técnica é facilitada pela distensão da parede abdominal com gás CO2, seguida da colocação de um endoscópio rígido através de uma cânula previamente colocada. Para biópsias ou outros procedimentos, os instrumentos são passados para a cavidade, através de portais adjacentes. A videolaparoscopia possui um grau de invasão mínimo e uma boa 8 precisão diagnóstica, aliados à rápida execução das manobras (ROTHUIZEN & TWEDT, 2009). Na maioria dos procedimentos, vários órgãos podem ser acessados, simultâneamente, com um pequeno número de portais, normalmente, dois ou três (MAYHEW, 2009). REFERÊNCIAS 1. AGRAWAL, C. M. Reconstructing the Human Body Using Biomaterials. Journal of Materials, New York, p. 31-35, 1998. 2. BELLÓN, J. M.; GARCÍA-CARRANZA, A.; JURADO, F.; GARCÍA- HONDUVILLA, N.; MARTIN, A. C.; BUJÁN, J. Peritoneal Regeneration after Implant of a Composite Prosthesis in the Abdominal Wall. World Journal of Surgery, New York, v. 25, p. 147-152, 2001. 3. BELLON, J. M.; GARCIA-HONDUVILLA, N.; SERRANO, N.; RODRIGUEZ, M.; PASCUAL, G.; BUJAN, J. 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A magnitude da resposta inflamatória de fase aguda a lesão cirúrgica é um importante fator para avaliação do estresse cirúrgico o qual pode ser determinado pelas medidas dos níveis séricos de citocinas e proteínas de fase aguda (PFA). Sabendo-se que polímeros naturais, como a quitosana, podem ser utilizados como revestimentos para biomateriais usados na reconstrução da parede abdominal, objetivou-se no presente estudo avaliar e comparar a resposta sistêmica aguda ao implante em suínos do compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana à tela de polipropileno isolada. Doze suínos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n=6). Um grupo recebeu o implante intraperitoneal de tela de polipropileno (PP), e o outro recebeu o implante intraperitoneal do compósito de polipropileno-filme à base de quitosana (PQ). As alterações sistêmicas foram avaliadas aos dois dias e sete dias pós-implante, por meio da contagem de leucócitos, proteína C-reativa, proteínas totais séricas e dosagem de albumina e globulinas. Como resultado não se observou diferença significativa entre os grupos (P1 > 0,05). Conclui-se que a resposta sistêmica ao compósito tela de polipropileno-quitosana foi similar à resposta promovida pela tela de polipropileno de alta gramatura, o que caracterizou a biocompatibilidade sistêmica da quitosana nas circunstâncias avaliadas. Palavras-chave: Quitosana, Leucócitos, Resposta de fase aguda. 14 ABSTRACT The systemic response caused by tissue lesion is well recognized by a number of humoral and cellular responses collectively known as acute inflammatory response. The events that characterize this response are leukocytosis, increased capillary permeability, increased blood levels of proteins produced in the liver, changes in the concentrations of steroids and minerals, in addition to fever. The magnitude of the acute phase inflammatory response to surgical lesion is an important factor for evaluation of surgical stress which can be determined by measurements of serum levels of cytokines and acute phase proteins (APP). Knowing that natural polymers such as chitosan can be used as coatings for biomaterials used in abdominal wall reconstruction, the aim of the present study was to evaluate and compare the acute systemic response to the implantation in pigs of the composite polypropylene mesh-chitosan based film to isolated polypropylene mesh. Twelve pigs were randomly divided into two groups (n = 6). One group received intraperitoneal implantation of polypropylene mesh (PP), and the other group received intraperitoneal implantation of composite polypropylenebased film of chitosan (PQ). The systemic changes were evaluated at two days and seven days post-implantation by means of leukocyte counts, C-reactive protein, seric total protein and albumin and globulins dosage As a result there was no significant difference between groups (P1> 0.05). We conclude that the systemic response of the composite polypropylene mesh-chitosan was similar to the response promoted by a thick isolated polypropylene mesh, which characterized the biocompatibility of chitosan on the systemic conditions evaluated. Keywords: Chitosan, leukocytes, acute phase response. 15 INTRODUÇÃO Alterações sistêmicas marcadas por leucocitose, aumento da permeabilidade capilar, aumento nos níveis sanguíneos de proteínas produzidas pelo fígado, mudanças nas concentrações de esteroides e de minerais além de febre, há muito tempo já são conhecidas como respostas sistêmicas quando um tecido é lesado ou agredido, seja por traumas ou infecções (GAULDIE et al.,1987). A produção de materiais prostéticos biocompatíveis tem contribuído para o aumento do seu uso no reparo de hérnias da parede abdominal. A avaliação laboratorial da resposta inflamatória ao trauma operatório objetivamente determina a magnitude do estresse promovido pelo procedimento cirúrgico. A resposta inflamatória é geralmente estimulada por um grupo de proteínas denominadas citocinas (GURLEYIK et al., 1998). Os mediadores químicos na fase aguda iniciam o processo de recuperação tecidual sendo representados pela IL-8, proteína quimiotáxica de monócitos tipo 1 (MCP-1), as citocinas TNF-α, IL 1-β, IL-6 fatores de crescimento transformante beta (TGF-β), fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) e fator de crescimento plaquetário (PDGF) (DIZEREGA, 1997; VAN DER WAL & JEEKEL, 2007). Os fatores de crescimento, juntamente com as citocinas, estimulam o fígado a produzir proteínas que irão aumentar em concentração na corrente sanguínea, conhecidas como proteínas de fase aguda positiva (PETERSEN et al., 2004). A proteína C-reativa geralmente aparece aumentada durante o curso de um processo inflamatório. Como uma proteína de fase aguda, primariamente sintetizada pelo fígado, fica reservada no sistema de retículo endoplasmático dos hepatócitos. Quando ocorre o estímulo para síntese da mesma, a ligação dessa proteína com o retículo endoplasmático fica diminuída, o que reflete no seu aumento sanguíneo (DU CLOS & MOLD, 2004). A proteína C-reativa interage com receptores das células fagocitárias para mediar a fagocitose e induzir a produção de citocinas anti-inflamatórias, bem como inibir a quimiotaxia das células polimorfonucleares (MURATA, et. al., 2004). Após o trauma, estas células são as primeiras a aparecer no local da lesão e 16 permanecem por um a dois dias em níveis elevados. A migração dos monócitos através da monocamada mesotelial e ao sítio da lesão é mais tardia (CHEONG et al., 2001; DIZEREGA & CAMPEAU, 2001). Agentes bioativos têm sido propostos com objetivo de proteger a tela da ação do sistema imune inato, modular a fibrose local em pacientes com deficiência de síntese de matriz extracelular e prevenir de infecções a tela. Polímeros naturais, como a quitosana, são estudados com esse intuito. São macromoléculas consideradas imunogênicas, que podem ser reconhecidas e metabolizadas pelo hospedeiro (JUNGE et al., 2012). As respostas imunogênicas desencadeadas por estresse, infecções, inflamações e traumas cirúrgicos podem ser monitoradas por meio de dosagens e observação de proteínas específicas produzidas pelo fígado (proteínas de fase aguda positiva). As concentrações presentes na circulação sanguínea aumentam de forma proporcional à gravidade, desordem, e extensão dos estímulos. As dosagens de algumas proteínas podem fornecer importantes informações de diagnóstico e prognóstico no tratamento de doenças (MURATA et al., 2004; PETERSEN et al., 2004). A dosagem de proteína C-reativa é considera um importante exame na avaliação das respostas inflamatórias sistêmicas e, também, como biomarcador de inflamação para a espécie suína (MURATA et al., 2004; ECKERSALL & BELL, 2010). O objetivo desse estudo foi avaliar e comparar a resposta sistêmica aguda ao implante do compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana à tela de polipropileno. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFG – COEP, sob o número 208/2011. Foram utilizados 12 suínos machos híbridos comerciais e hígidos, com peso médio inicial de 16,25 kg ± 2,34 kg, oriundos do setor de suinocultura da Escola de Veterinária e Zootecnia, da Universidade Federal de Goiás. Os animais foram identificados com números nas orelhas, conforme o sistema de marcação australiano. Foram alocados em baias de alvenaria, recebendo água potável e ração comercial ad libitum (Ração 17 Performance Porco®, Boiforte Produtos Agropecuários LTDA, Hidrolândia - GO). O período de adaptação e monitoramento clínico após a chegada dos suínos foi de sete dias. Todos foram pesados ao início do experimento. Para avaliar e comparar a resposta sistêmica aguda ao implante do compósito tela de polipropileno filme à base de quitosana os suínos foram alocados aleatoriamente em dois grupos, cada um com seis animais. O grupo que recebeu o implante intraperitoneal de tela de polipropileno foi denominado PP, e o grupo que recebeu o implante intraperitoneal do compósito de polipropileno-filme à base de quitosana foi chamado de PQ. As telas cirúrgicas de polipropileno com espessura de 0,45 mm e poros de 0,5 mm2 (Intracorp®, Venkuri indústria de produtos médicos, São Paulo - SP) foram recortadas no momento da aplicação no tamanho de 4 cm x 4 cm (Figura 1A). Os compósitos de mesmo tamanho foram preparados a partir das mesmas telas de polipropileno, revestidas de um filme espesso (2QM) de quitosana, com grau de 95% de desacetilação, que recobriu somente uma face da tela, por meio da técnica de imersão (Figura 1B), conforme descrito por RAMMAZZINA FILHO (2011). Os compósitos foram desenvolvidos no Laboratório de Engenharia de Biorreações e Colóides da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas, São Paulo. A esterilização do compósito foi por exposição a óxido de etileno (ACECIL- Central de esterilização comércio e indústria LTDA, Campinas - SP). FIGURA 1 - (A) Tela cirúrgica de polipropileno. (B) Compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana. 18 Antes da implantação na parede abdominal, as telas de polipropileno e os compósitos foram imersos em solução de ringer durante trinta minutos (Ringer 500 ml blowpack®, Halex Istar, Goiânia-GO). Os animais foram submetidos ao protocolo anestésico, que consistiu de medicação pré-anestésica (MPA) por dose única da associação cetamina 10 mg/kg (Ketamina Agener 10%®, Agener União-Saúde animal, Embu Guaçu-SP), azaperone 3mg/kg (Destress® , DES-FAR Laboratórios LTDA, São Paulo-SP) e midazolam 0,5 mg/kg (Dormonid injetável®, Roche, São Paulo-SP), por via intramuscular profunda. Após o decúbito do animal, foi introduzido um cateter intravenoso na veia auricular, para indução da anestesia geral com propofol 3mg/kg (Diprivan®, AstraZeneca, Cotia–SP) e posterior intubação orotraqueal. A anestesia foi mantida pela administração de isofluorano (Isofluorano ®, Instituto BioChimico e indústria Farmacêutica Ltda, Itatiaia-RJ) com fluxo diluente de oxigênio de 30 ml/kg/min. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados pela mesma equipe. Procedeu-se à laparotomia paramediana transversal direita, próxima da cicatriz umbilical, com aproximadamente seis cm de comprimento. Foi realizada a secção na seguinte ordem: pele, tecido subcutâneo, músculo oblíquo abdominal externo, bainha externa e o corpo do músculo reto do abdômen e sua bainha interna. Após a visualização do músculo transverso do abdome, criou-se um defeito da parede abdominal por meio da excisão de um fragmento longitudinal deste músculo. O peritônio parietal foi então incisado, permitindo a sua retração. As telas foram fixadas às margens do defeito por sutura continua simples. No grupo PQ, a face revestida pelo filme de quitosana ficou voltada para a cavidade peritoneal. Os planos musculares e o tecido subcutâneo foram aproximados também por meio de sutura padrão contínua simples. Todas as suturas foram feitas com fio monofilamentado de polipropileno 2-0 (Figura 2). A analgesia no período pós-operatório foi garantida pela aplicação intramuscular de tramadol 2,0 mg/kg (Cloridrato de tramadol®, União Química Farmacêutica, São Paulo, SP, Brasil), a cada oito horas, nas primeiras 24 horas, e dipirona 25 mg/kg (Analgex V®, Agener União-Saude animal, Embu Guaçu-SP) a cada 12 horas durante cinco dias. A antibioticoterapia foi realizada com a aplicação de três doses de 20.000 UI de benzilpenicilina benzatina/kg de peso 19 vivo (Benzetacil®, Eurofarma Laboratórios LTDA, São Paulo-SP), com intervalos de 48 horas. A ferida cirúrgica foi limpa diariamente com solução salina 0,9% (solução salina 0,9%®,Halex Istar, Goiânia-GO) e desinfetada com solução tópica de iodo-povidona (Povidine®, Johnson & Johnson, São José dos Campos–SP) até a completa cicatrização. FIGURA 2 – Tela cirúrgica de polipropileno implantada intraperitonialmente corrigindo defeito induzido experimentalmente na parede abdominal de suíno. Os animais foram avaliados quanto a possível presença de alterações como: vermelhidão, aumento de volume da região, exsudação e sensibilidade ao toque por meio de inspeção visual e palpação até o final do experimento, para verificação da presença de hematoma, seroma e infecção da ferida cirúrgica. Parâmetros laboratoriais foram obtidos antes e após os procedimentos cirúrgicos, em três momentos: 24 horas antes (momento zero - M0), dois dias após a cirurgia (momento um – M2) e sete dias após (momento dois – M7). Para realização dos exames, amostras de sangue foram colhidas da veia jugular externa após antissepsia prévia e alocadas em tubos com anticoagulante EDTA e sem anticoagulante (Vacuette®, Greiner Bio-One Brasil, Americana–SP). Para o leucograma utilizou-se 3ml de sangue, que foram processados em analisador hematológico automático veterinário (ABC VET®, ABX Diagnostics, Montpellier França). Processou-se ainda, a leitura morfológica diferencial dos leucócitos, por meio de esfregaços de sangue, corados com corante rápido (Panóptico®, 20 Laborclin, Pinhais-SP). Do sangue colhido sem anticoagulante, 4ml do soro foram obtidos por centrifugação, necessários às análises bioquímicas. Para a mensuração da proteína total sérica e albumina foram utilizados os métodos colorimétricos de ponto final, utilizando a reação de biureto e a do verdi bromocresol em meio ácido, respectivamente. A dosagem da proteína Creativa foi realizada pelo método de turbidimetria (PCR Turbilatex®, Biotécnica, Varginha–MG). As análises bioquímicas foram realizadas em equipamento bioquímico semiautomático (BIO-2000®, Bioplus-Brasil). Todas as amostras foram processadas e analisadas no mesmo dia da colheita. Os valores basais obtidos em M0 serviram de referência para comparação dos resultados de laboratório para todos os animais. Os dados foram analisados com auxílio do software livre R (R Core Team, 2013) utilizando de ANOVA, seguido de múltiplos testes de comparação com valores de P significantes, quando P < 0,05. Os valores de P1 indicam comparações entre os tratamentos, já os valores de P2 comparações entre os momentos. RESULTADOS O peso médio dos animais foi 16,25 kg, semelhante estatisticamente entre os grupos (P = 0,1118). No pós-operatório foi observado seroma nos primeiros 15 dias em 33,33% dos animais do grupo PP e 16,67% do grupo PQ. Infecção superficial da ferida cirúrgica ocorreu em dois animais (33,33%) dos animais do grupo PP e em três animais (50%) do grupo PQ. Não houve diferença significativa entre o grupo PP e PQ na contagem de leucócitos totais, bastonetes, neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos (P1 > 0,05), exceto para os monócitos que variaram entre os momentos (P2 < 0,05) conforme Tabela 1. 21 TABELA 1 – Contagem média dos elementos celulares sanguíneos avaliados no grupo PP e PQ, 24 horas antes da cirurgia (M0), aos dois e sete dias após a cirurgia (M2, M7). Goiânia, 2013. Grupos Variável (mm3) Leucócitos Momento PP M0 M2 M7 11350 14567 12267 386 510 271 3500 5086 5598 120 247 198 6799 8033 5612 PQ 8800 11117 12433 376 264 365 3112 4256 5094 105 257 319 4952 5756 6044 P1 P2 0,2655 0,0610 M0 Bastonetes M2 M7 M0 M2 M7 0,5394 0,7663 Neutrófilos 0,6769 0,0529 M0 Eosinófilos M2 M7 M0 M2 M7 0,3341 0,0700 Linfócitos 0,0784 0,2246 M0 542 253 Monócitos M2 690 583 0,4014 0,0214* M7 587 610 * P < 0,05 - Estatisticamente significativos. Os valores de P1 indicam comparações entre os tratamentos, os valores de P2 comparações entre os momentos. A dosagem da proteína C-reativa, assim como das proteínas séricas, albumina e globulinas, dois e sete dias após o implante, não revelou variação significativa entre os grupos (P1 > 0,05). Já a dosagem de proteínas séricas totais e albumina mostrou diferença significativa entre os momentos (P2 < 0,05) esses resultados são evidenciados na Tabela 2. 22 TABELA 2 – Dosagem em valores médios de proteínas sanguíneas avaliadas no grupo PP e PQ, 24 horas antes da cirurgia (M0), aos dois e sete dias após a cirurgia (M2, M7). Goiânia, 2013. Grupos Variável Proteína C-reativa mg/L Momentos PP M0 M2 M7 Proteínas Séricas g/dL M0 M2 M7 Albumina g/dL M0 M2 M7 Globulinas g/dL M0 M2 M7 2,30 2,06 1,48 PQ 1,34 2,31 1,56 0,5392 0,2071 P1 P2 4,90 4,86 5,59 4,97 5,12 5,33 0,8340 0,0483* 3,55 3,26 3,77 3,70 3,70 3,91 0,4283 0,0013* 1,38 1,61 1,82 1,27 1,42 1.43 0,4268 0,1819 *P < 0,05 - Estatisticamente significativos. Os valores de P1 indicam comparações entre os tratamentos, os valores de P2 comparações entre os momentos. DISCUSSÃO A reação inflamatória local ao biomaterial pode ter sido responsável pelo seroma na região do implante observado nos dois animais do grupo PP e em um animal do grupo PQ nos primeiros dias do período pós-cirúrgico. Seroma que não exigiu intervenção e cursando durante 15 dias até a resolução, também foi um achado de OBER et al. (2008b); VILAR et al. (2009); VILAR et al. (2011) quando implantaram telas de polipropileno para o reparo de defeitos de parede abdominal em bovinos, equinos e caprinos respectivamente. A avaliação da 23 biocompatibilidade de um implante construído pela engenharia de biomaterial inclui a determinação da resposta sistêmica do hospedeiro aos componentes do material, dos tecidos e a combinação dos dois. A duração e a intensidade das reações são dependentes da extensão da lesão criada durante a implantação e da composição química do biomaterial, dentre outras, influenciando o grau do processo inflamatório local. Apesar de ter ocorrido o processo inflamatório local, certamente este não foi suficientemente intenso para refletir uma resposta sistêmica significativa ao biomaterial implantado. Este resultado, conhecido como resposta inflamatória aguda, foi reconhecido por GAULDIE et al. (1987) diferentemente da que foi encontrado neste estudo, no qual os valores obtidos da dosagem de proteína Creativa, substância que aparece precocemente nos processos inflamatórios, não aumentaram entre os momentos avaliados. Os achados com relação à reação inflamatória sistêmica contrariam os de DI VITA et al. (2000) que consideram que reparação abdominal com baixa tensão promovido pela utilização de telas pode ser associada a um aumento dos mediadores inflamatórios nas primeiras 48 horas, provavelmente causado pela reação de corpo estranho. Pode se inferir que no presente estudo o tamanho do defeito criado, em relação ao porte dos animais, não foi suficiente para desencadear uma leucocitose significativa nos dois grupos avaliados. A leucocitose foi um achado após implante intraperitonial de telas, por DI VITA et al. (2000) e UZUNKOY et al. (2000) em humanos, OBER et al. (2008a) em equinos, CHATZIMAVROUDIS et al. (2008) em leporinos. O tamanho das telas testadas do presente experimento foi o mesmo usado por MARTÌNCARTES et al. (2006), que foi proporcionalmente menor aos usados por esses autores. O tamanho da tela pode ter contribuído para uma menor resposta sistêmica proporcional conforme salientaram GAULDIE et. al. (1987). Essa ideia foi reforçada por GURLEYIK et al. (1998) quando afirmaram que a magnitude da resposta inflamatória de fase aguda é um importante fator para avaliar o grau de traumatismo de um procedimento cirúrgico. O aumento nos marcadores da resposta inflamatória sistêmica está associado a procedimentos cirúrgicos invasivos, que dependendo da extensão da lesão, provocará a elevação do número dos leucócitos circulantes sanguíneos, que nem sempre é acompanhado de processos infecciosos. 24 Embora no presente estudo a resposta inflamatória local não tenha sido avaliada, o aumento significativo dos monócitos circulantes, observados nos dois grupos de animais nos momentos M2 e M7, representam um forte indicativo de cronificação do processo inflamatório desencadeado pela implantação do biomaterial. O comportamento sistêmico dessas células foi semelhante ao relatado por CHEONG et al., (2001) e DIZEREGA & CAMPEAU, (2001) que notaram o aumento dessas células até o sétimo dia da reparação peritonial, após o trauma. Diferente resultado foi observado por DI VITA et al. (2000) quando analisaram o comportamento sistêmico dos monócitos e linfócitos nas primeiras 6 e 24 horas após reparação de hérnia em humanos utilizando da técnica de baixa tensão. As ativações dos macrófagos no sítio do implante em conjunto com a proliferação dos fibroblastos determinam o início do processo de inflamação crônica, necessário para o desencadeamento do mecanismo de incorporação dos biomateriais. Baseado no conceito de VASCONCELOS (2006) esperar-se-ia que a espessura 2QM de 1,2 mm do filme à base de quitosana desencadeasse uma resposta sistêmica e imunogênica mais acentuada no grupo PQ, como salientado por JUNGE et al. (2012). No entanto, o evento não foi observado no presente estudo, conforme demonstrou a comparação dos valores de todos os leucócitos e a dosagem de proteína C-reativa entre os grupos. As propriedades físicas e químicas dos biomateriais, sua topografia e forma são importantes para definir o tipo, intensidade e a duração da resposta inflamatória. A diminuição significativa esperada dos níveis da albumina, também relatada por MURATA et al. (2004), PETERSEN et al. (2004) e CRAY et al. (2009), refletiu uma resposta adequada dos animais. As proteínas de fase aguda podem diminuir ou aumentar em respostas às alterações na homeostase. Agentes pró-inflamatórios são liberados pelos macrófagos e outras células em respostas a vários estímulos externos e internos. Esses estímulos promoverão a ativação dos hepatócitos para síntese de proteínas de fase aguda positiva, concomitantemente, ocorre a diminuição da síntese de proteínas de fase aguda negativa, como a albumina, que é o constitutivo proteico plasmático mais abundante. 25 CONCLUSÃO A resposta sistêmica do compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana foi similar a resposta promovida pela tela de polipropileno de alta gramatura, o que caracterizou a biocompatibilidade sistêmica da quitosana nas circunstâncias avaliadas. REFERÊNCIAS 1. CHATZIMAVROUDIS, TSAGANOS, T.; G.; KOUTELIDAKIS, I.; PAPAZIOGAS, B.; E.; KOUTOUKAS, P.;·GIAMARELLOS-BOURBOULIS, ATMATZIDIS, S.;·ATMATZIDIS, K. The effect of the type of intraperitoneally implanted prosthetic mesh on the systemic inflammatory response. Hernia, Paris, v.12, 277-283, 2008. 2. CHEONG, Y.C.; LAIRD, S. M.; LI T. C.; SHELTON, J. B.; LEDGER, W. COOKE, I. D. Peritoneal healing and adhesion formation/ reformation. Human Reproduction Update, Oxford, v. 7, p. 556-566, 2001. 3. CRAY, C.; ZAIAS, J.; ALTMAN, N. H. Acute Phase Response in Animals: A Review. Comparative Medicine, Memphis, v. 59, n. 6, p. 517-526, 2009. 4. DI VITA, G.; MILANO, S.; FRAZZETTA, M.; PATTI, R.; PALAZZOLO, V.; BARBERA, C.; FERLAZZO, V.; LEO, P.; CILLARI, E. Tension-Free Hernia Repair Is Associated with an Increase in Inflammatory Response Markers against the Mesh. The American Journal of Surgery, New York, v.180 p.203-207, 2000. 5. DIZEREGA, G. S. Biochemical events in peritoneal tissue repair. European Journal of Surgery, Stockholm, v. 577, p.10-16, 1997. 6. DIZEREGA, G. S.; CAMPEAU J. D. Peritoneal repair and post-surgical adhesion formation. Human Reproduction Update, Oxford, v. 7, p. 547-555, 2001. 7. DU CLOS, T. W.; MOLD C. C-Reactive Protein. Immunologic Research, Basel, v. 30/3, p. 261–277, 2004. 26 8. ECKERSALL, P. D.; BELL, R. Acute phase proteins: Biomarkers of infection and inflammation in veterinary medicine. The Veterinary Journal, London, V.185, p. 23–27, 2010. 9. GAULDIE, J.; RICHARDS, C.; HARNISH, D.; LANSDORP, P.; BAUMANN, H. Interferon β2/B-cell stimulatory factor type 2 shares identity with monocytederived hepatocyte-stimulating factor and regulates the major acute phase protein response in liver cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v. 84, p. 7251-7255, 1987. 10. GURLEYIK, E.; GURLEYIK, G.; CETINKAYA, F.; UNALMISER, S. The Inflammatory Response to Open Tensionfree Inguinal Hernioplasty Versus Conventional Repairs. The American Journal of Surgery, New York, v.175, p. 179-182 1998. 11. JUNGE, K.; BINNEBÖSEL, M.; TROTHA, K. T. V.; ROSCH, R.; KLINGE, U.; NEUMANN, U. P.; JANSEN, P. L. Mesh biocompatibility: effects of cellular inflammation and tissue remodeling. Langenbeck's Archives of Surgery, Berlin, v. 397, p. 255-270, 2012. 12. MARTÍN-CARTES, J. A.; MORALES-CONDE, S.; SUÁREZ-GRAU, J. M.; BUSTOS-JIMÉNEZ, M.; CADET-DUSSORT, H.; SOCAS-MACIÁS, M.; LÓPEZ-BERNAL, F.; ALAMO-MARTINEZ, J. M.; TUTOSAUS-GOMEZ, J. D.; MORALES-MENDEZ, S. Prevención de adherencias peritoneales a las prótesis intraperitoneales. Estudio experimental em cerdos. Cirugía Española, Barcelona, v.80, n.4, p. 214-219, 2006. 13. MURATA, H.; SHIMADA, N.; YOSHIOKA, M. Current research on acute phase proteins in veterinary diagnosis: an overview. The Veterinary Journal, London, v.168, p. 28–40, 2004. 14. OBER, C.; MUSTE, A., OANA, L.; MATES, N.; BETEG, F. Systemic response to polypropylene mesh used for the repair of abdominal wall defects in horses. Lucrări Stiinłifice Medicină Veterinară, Timisoara, v. 41, p. 237-242, 2008a. 15. OBER, C.; MUSTE, A.; OANA, L.; MATES, N.; BETEG, F.; VERES, S. Using of prosthetic biomaterials in large animals: modern concepts about abdominal 27 wall defects approach. Journal Central European Agriculture, Zagreb, v. 9 n.3, p. 575-580, 2008b. 16. PETERSEN, H. H.; NIELSEN, J. P.; HEEGAARD, P. M. H. Application of acute phase protein measurements in veterinary clinical chemistry. Veterinary Research, Les Ulis, v.35, p.163–187, 2004. 17. R CORE TEAM. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, 2013. 18. RAMMAZZINA FILHO, W. A. Recobrimento de Tela de Polipropileno com Quitosana e Polietileno Glicol por Deposição via Electrospinning [online]. 2011. 121f. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos) - Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas. Campinas. Disponível em: Acesso http://www.bibliotecadigital.unicamp.br/document/?view=000834930. em 19 set. 2012. 19. UZUNKOY, A.; COSKUN, A.; FARUK AKINCI, O.; KOCYIGIT, A. Systemic Stress Responses after Laparoscopic or Open Hernia Repair. The European Journal of Surgery, Stockholm, v. 166, p 467–471, 2000. 20. VAN DER WALT, J. B.C.; JEEKEL, J. Biology of the peritoneum in normal homeostasis and after surgical trauma. The Association of Coloproctology of Great Britain and Ireland, London, v. 9, suplemento 2, p. 9-13. 2007. 21. VASCONCELOS, A. C. Processo inflamatório relacionado com a presença de biomateriais. In: ORÉFICE, R. L.; PEREIRA, M. M.; MANSUR H. S. Biomateriais Fundamentos & Aplicações. 1. ed. Cultura médica, 2006. Cap. 10, p. 269-281. 22. VILAR, J. M.; DORESTE, F.; SPINELLA, G.; VALENTINI, S. Double-Layer Mesh Hernioplasty for Repair of Incisional Hernias in 15 Horses. 2009. Journal of Equine Veterinary Science, Las Palmas, v. 29, n. 3, p.172-176, 2009. 23. VILAR, J. M.; CORBERA, J. A.; SPINELLA, G. Double-layer mesh hernioplasty for repairing umbilical hernias in 10 goats. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, Ankara, v.35, n.2, p. 131-135, 2011. 28 CAPÍTULO 3 - Aderências e reações teciduais após implante intraperitonial do compósito polipropileno-filme à base de quitosana e da tela de polipropileno, na parede abdominal de suínos RESUMO Telas de polipropileno têm sido frequentemente relacionadas a complicações como aderências, obstruções intestinais, formação de fístulas enterocutâneas. A quitosana pode servir para evitar o contato direto da tela com peritônio visceral. O objetivo desse estudo foi avaliar se o filme à base de quitosana apresentaria potencial anti-adesiogênico em suínos, bem como se este material conseguiria modular as respostas teciduais. Foram utilizados 12 suínos machos, divididos aleatoriamente em dois grupos com seis animais; o grupo PP recebeu o implante intraperitoneal de tela de polipropileno, e o grupo PQ recebeu o implante intraperitoneal do compósito de polipropileno- filme à base de quitosana. Aos 28 dias pós-operatório, avaliações ultrassonográficas e vídeo-laparoscópicas foram realizadas, seguidas de eutanásia e posterior colheita de material para avaliações histológicas. A avaliação ultrassonográfica mostrou índice de acerto de 78,57% em relação as imagens obtidas por videolaparoscopia no diagnóstico das aderências. Não houve diferença significativa entre os dois grupos quanto à formação aderências (P > 0,05). A resposta inflamatória total foi maior no grupo PP comparada ao grupo PQ (P = 0,0033). As células polimorfonucleares apresentaram-se estatisticamente aumentadas em número na região do implante no grupo PQ (P = 0,0068). A observação do colágeno demonstrou discrepância significativa entre os dois grupos (P = 0,0154 para o colágeno tipo I e P = 0,0037 para o colágeno total). Concluiu-se que o compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana não preveniu totalmente a formação de aderências e a reação tecidual não foi acompanhada de respostas de inflamação granulomatosa característica da incorporação. Palavras-chave: Quitosana, Telas cirúrgicas, Peritônio, Colágeno, Ultrassonografia, Laparoscopia. 29 ABSTRACT A polypropylene mesh, despite being widely accepted in the surgical routine, has often been related to complications such as adhesions, intestinal obstruction, enterocutaneous fistula formation. This material has been improved in its physical and chemical characteristics. Among the modifications, adding another biomaterial as chitosan can serve to avoid direct contact of the screen with the visceral peritoneum. The aim of this study was to evaluate whether the chitosan -based film present anti-adherent potential as well if this material could modulate tissue responses. Twelve male pigs randomly divided into two groups of six animals, were used in the study. The PP group received intraperitoneal implantation of polypropylene mesh, and the PQ group received intraperitoneal implantation of the composite polypropylene-chitosan based film. At 28 days postoperative, videolaparoscopic and ultrasonographic evaluations were performed, followed by euthanasia and subsequent harvesting of material for histological evaluations. The ultrasonographic evaluation showed success rate of 78.57% over the images obtained by video-laparoscopy in the diagnosis of adhesions. There was no significant difference between the two groups regarding adhesion formation (P> 0.05). The overall inflammatory response was higher in the PP group compared to PQ group (P = 0.0033). Polymorphonuclear cells were statistically increased in number the region of the implant in PQ group (P = 0.0068). The observation of collagen showed significant discrepancy between the two groups ( P = 0.0154 for collagen type I and P = 0.0037 for total collagen). It was concluded that the composite polypropylene mesh -chitosan based film did not prevented totally the formation of adhesions and that tissue reaction was not accompanied by granulomatous inflammation response characteristic of the embodiment. Keywords: Chitosan, Surgical mesh, Peritoneum, Collagen, Ultrasonography, Laparoscopy. 30 INTRODUÇÃO A busca pela restauração funcional de partes do corpo lesado por traumas ou doenças tem sido alvo da espécie humana desde tempos remotos (AGRAWAL, 1998). A medicina regenerativa tem como foco o desenvolvimento de células, tecidos e órgãos para o propósito de restaurar funções do corpo por meio de implantes (SALGADO et al., 2012). O grande desafio da engenharia de tecidos é promover a substituição de tecidos vivos, que são resultados de milhões de anos de evolução, por materiais que necessitam de ajustes de características e propriedades que se adequem a este fim (HENCH, 2006). A parede abdominal é uma parte do corpo que tem despertado interesse de estudiosos de biomateriais, o que tem revolucionado a cirurgia para o reparo de alguns defeitos, como as hérnias. O uso de biomateriais para correção de defeitos de parede visa promover o seu reparo, sem tensão (MATTHEWS et al., 2003). A interface formada entre peritônio e um biomaterial usado para reconstrução de parede abdominal é o objetivo das investigações a respeito do desempenho do material prostético e visa minimizar as complicações póscirúrgicas, especialmente as aderências (BELLON et al. 2007). Tais complicações são exemplos que ocorrem com frequência quando se emprega telas na reparação da parede abdominal, entretanto, esses materiais são largamente usados na rotina cirúrgica, sendo o seu implante considerado padrão na maioria dos países (BELLOWS et al., 2008; FODA & CARLSON, 2009; BROWN & FINCH, 2010). As aderências ocorrem principalmente quando a tela é posicionada intraperitonialmente (AMMATURO et al., 2010). Após o trauma, o peritônio sofre um aumento da permeabilidade capilar mediado por histamina, com exsudação inflamatória e deposição de fibrina. As células polimorfonucleares (PMN) são as primeiras a aparecer no local da lesão e lá permanecem por um a dois dias em níveis elevados. A migração dos monócitos, através da monocamada mesotelial e ao sítio da lesão, é mais tardia. Os monócitos aderem na superfície, diferenciam-se em macrófagos e após três dias começam a ser encobertos pelo mesotélio, ficando então, mais profundos. 31 Normalmente, a matriz de fibrina interconecta as duas membranas peritoniais. A atividade fibrinolítica é suprimida e como resultado, ocorre a persistência de feixes de fibrina, posteriormente infiltrados por fibroblastos, que organizarão as aderências na forma que são identificadas clinicamente (CHEONG et al., 2001; DIZEREGA & CAMPEAU, 2001) Uma tela cirúrgica deve ser suficientemente incorporada ao tecido hospedeiro para evitar a recorrência do defeito original e a migração da tela. Contudo, é difícil combinar estes requisitos com apenas um tipo de material, uma vez que algumas características que promovem a incorporação da tela também induzem a formação de aderências (VAN’RIET et al. 2003). Mas as próteses de compósitos têm como objetivo melhorar a interface com o peritônio visceral. O compósito combina a ação de dois biomateriais com propriedades distintas. Um geralmente é reticular, como as telas de polipropileno, cujos poros servem como pontos para infiltração do tecido hospedeiro, o outro elemento entra em contato com o peritônio visceral e ajuda na modulação da reação nesse sítio (BELLÓN et al., 2005). A quitosana tem despertado interesse no estudo da prevenção de aderências, conforme relatado por PAULO et al. (2009), e cicatrização de feridas (JAYKUMAR et al., 2011). A quitosana é um polissacarídeo produzido pela desacetilação da quitina, que por sua vez é o principal componente do exoesqueleto de artrópodes. Suas propriedades baixa gerais incluem atividade biocompatibilidade, biodegradabilidade, toxicidade, antimicrobiana, facilidade de processamento, baixo custo e possibilidade de esterilização (ZHOU et al., 2007; SALGADO et al., 2012). Graças à sua aplicabilidade em dispositivos de uso médico, filmes derivados desta fibra têm sido usados (ZHOU et al., 2007). A quitosana apresenta ainda a vantagem de ser reconhecida e metabolizada pelo ambiente biológico devido a sua similaridade com outras macromoléculas reconhecidas e metabolizadas pelo organismo (JUNGE et. al., 2012). O objetivo deste estudo foi avaliar a ocorrência e a morbidade das aderências e respostas teciduais, induzidas pelo compósito tela de polipropilenofilme à base de quitosana, implantado intraperitonialmente em suínos. 32 Estabelecer a correlação entre os resultados obtidos do exame de ultrassonografia e de videolaparoscopia. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFG – COEP, sob o número 208/2011. Foram utilizados 12 suínos machos, híbridos comerciais e hígidos, com peso médio inicial de 16,25 kg ± 2,34 kg, oriundos do setor de suinocultura da Escola de Veterinária e Zootecnia, da Universidade Federal de Goiás. Os animais foram identificados com números nas orelhas, conforme o sistema de marcação australiano. Foram alocados em baias de alvenaria, onde receberam água potável e ração comercial ad libitum (Ração Performance Porco®, Boiforte Produtos Agropecuários LTDA, Hidrolândia - GO). O período de adaptação e monitoramento clínico, após a chegada dos animais, foi de sete dias. Todos os animais foram pesados no início (M0) e no final do experimento (M28). Para avaliar a ocorrência e a morbidade das aderências os suínos foram alocados aleatoriamente em dois grupos, cada um com seis animais. O grupo que recebeu o implante intraperitoneal de tela de polipropileno foi denominado PP, e o grupo que recebeu o implante intraperitoneal do compósito de polipropileno-filme à base de quitosana foi chamado de PQ. As telas cirúrgicas de polipropileno com espessura de 0,45 mm e poros de 0,5 mm2 (Intracorp®, Venkuri indústria de produtos médicos, São Paulo - SP) foram recortadas no tamanho de 4 cm x 4 cm (Figura 1A). Os compósitos de mesmo tamanho foram preparados a partir de telas de polipropileno revestidas de um filme espesso (2QM) de quitosana com grau de 95% de desacetilação que recobriu somente uma face da tela, por meio da técnica de imersão (Figura 1B), conforme descrito por RAMMAZZINA FILHO (2011). Os compósitos foram desenvolvidos no Laboratório de Engenharia de Biorreações e Colóides da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas, São Paulo. A esterilização do compósito foi por exposição ao óxido de etileno (ACECIL- Central de esterilização comércio e indústria LTDA, Campinas - SP). 33 FIGURA 1 - (A) Tela de polipropileno. (B) Compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana. Fragmentos dos biomateriais antes do implante foram analisados no Laboratório Multiusuário de Microscopia de Alta Resolução (LabMic), da Universidade Federal de Goiás. Os fragmentos foram submetidos ao processo de metalização em ouro e as imagens foram obtidas por meio de Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) (JSM – 6610®, Jeol, USA). Antes da implantação na parede abdominal, as telas de polipropileno e os compósitos foram imersos em solução de ringer, durante trinta minutos (Ringer 500 ml blowpack®, Halex Istar, Goiânia-GO). Os animais foram submetidos ao protocolo anestésico, que consistiu de medicação pré-anestésica (MPA), por dose única da associação cetamina 10 mg/kg (Ketamina Agener 10%®, Agener União-Saúde animal, Embu Guaçu-SP) azaperone 3 mg/kg (Destress® , DES-FAR Laboratórios LTDA, São Paulo-SP) e midazolam 0,5 mg/kg (Dormonid injetável®, Roche, São Paulo-SP), por via intramuscular profunda. Após o decúbito do animal, foi introduzido um cateter intravenoso na veia auricular, para indução da anestesia geral com propofol 3mg/kg (Diprivan®, AstraZeneca, Cotia–SP) e posterior intubação orotraqueal. A anestesia foi mantida pela administração de isofluorano (Isofluorano ®, Instituto BioChimico e indústria Farmacêutica Ltda, Itatiaia-RJ), com fluxo diluente de oxigênio de 30 ml/kg/min. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados pela mesma equipe. Procedeu-se à laparotomia paramediana transversal direita, próxima da 34 cicatriz umbilical com aproximadamente 6 cm de comprimento. Foi realizada a secção na seguinte ordem: pele, tecido subcutâneo, músculo oblíquo abdominal externo, bainha externa e o corpo do músculo reto do abdome e sua bainha interna. Após a visualização do músculo transverso do abdome, criou-se um defeito da parede abdominal, por meio da excisão de um fragmento longitudinal deste músculo. O peritônio parietal foi então incisado permitindo a sua retração. No grupo PQ, a face revestida pelo filme de quitosana ficou voltada para a cavidade peritonial. As telas foram fixadas às margens do defeito por sutura continua simples. Os planos musculares e o tecido subcutâneo foram aproximados também por meio de sutura contínua simples. Todas as suturas foram feitas com fio monofilamentado de polipropileno 2-0 (Figura 2 A, B, C e D). FIGURA 2 - Região cirúrgica após secção da pele, tecido subcutâneo e músculo oblíquo abdominal externo com visualização da bainha externa do musculo reto abdominal em suíno (A); Excisão de fragmento do músculo transverso do abdome com visualização e exposição do peritônio parietal (B); Implante da tela após incisão do peritônio com sutura contínua simples (C e D). A analgesia no período pós-operatório foi garantida pela aplicação intramuscular de cloridrato de tramadol 2,0 mg/kg (Cloridrato de tramadol®, União 35 Química Farmacêutica, São Paulo, SP, Brasil), a cada oito horas, nas primeiras 24 horas, e dipirona 25 mg/kg (Analgex V®, Agener União-Saude animal, Embu Guaçu-SP), a cada 12 horas, durante 5 dias. A antibioticoterapia foi realizada com a aplicação de três doses, de 20.000 UI de benzilpenicilina benzatina/kg, de peso vivo (Benzetacil®, Eurofarma Laboratórios LTDA, São Paulo-SP), com intervalos de 48 horas. A ferida cirúrgica foi limpa diariamente com solução salina 0,9% (solução salina 0,9%®,Halex Istar, Goiânia-GO) e desinfetada com solução tópica de iodo-povidona (Povidine®, Johnson & Johnson, São José dos Campos–SP) até a completa cicatrização. Os animais foram avaliados quanto a possível presença de alterações como: vermelhidão, aumento de volume da região do implante, exsudação e sensibilidade ao toque por meio de inspeção visual e palpação até o final do experimento, para verificação da presença de hematoma, seroma e infecção da ferida cirúrgica. Aos 28 dias após a implantação das telas, os animais receberam os mesmos protocolos pré-anestésicos e de anestesia geral, utilizados nos procedimentos de implantação do biomaterial, acrescidos de bloqueio local com lidocaína nos portais de acesso para cavidade peritonial. A pele do abdome foi lavada com água e sabão e fez-se a tricotomia entre a cartilagem xifóide e o púbis, estendendo-se lateralmente para região dorsal aos músculos lombares direito e esquerdo. Os animais foram posicionados em decúbito dorsal para a realização dos exames de ultrassonografia e, em seguida, a videolaparoscopia, para o inventário dos achados. As imagens foram produzidas com aparelho de ultrassonografia (MYLAB 30 VET®, Esaote Group, Genova, Itália) utilizando transdutor linear multifrequencial (7,5 MHz a 12 MHz), com a frequência selecionada em 12 MHz. Para auxiliar no contato acústico entre o transdutor e a pele foi aplicado gel ultrassonográfico. O estudo foi realizado de modo mascarado, sendo que a execução e a interpretação dos exames foram de responsabilidade de apenas um avaliador, sem o prévio conhecimento do resultado da videolaparoscopia. O exame ultrassonográfico foi utilizado primeiramente com o objetivo de determinar a topografia dos músculos e bainhas que compõem a parede abdominal do suíno na área do implante, o transdutor foi posicionado transversalmente sobre a linha média (Figura 3, detalhe). A linha alba e as 36 camadas musculares foram identificadas nas duas laterais à direita e esquerda (Figura 3). A identificação topográfica dos músculos foi realizada com base nos estudos de MOKINI et al. (2011) e HERRING et al. (2012) para avaliações da parede abdominal de seres humanos. Na sequência para visibilização da área do implante, o transdutor foi posicionado sobre a cicatriz cirúrgica para identificação do biomaterial. As descrições dos achados foram adaptadas de resultados de estudos conduzidos por JAMADAR et al. (2008) em pacientes humanos, por VILAR et al. (2009) em equinos e por VILAR et al.( 2011) em caprinos. FIGURA 3 – Sonograma transversal da parede abdominal de suíno em que se identifica a linha alba (seta) e a equivalência à direita e à esquerda das camadas musculares; músculo oblíquo externo do abdome (OE); músculo reto do abdome (R); músculo transverso do abdome (T). No detalhe, transdutor posicionado sobre a linha média. Os vídeos produzidos na cavidade abdominal foram obtidos com equipamento de videolaparoscopia (Karl Storz®, Tuttlingen, Alemanha). Após a tricotomia, foi realizada a marcação de três pontos no abdômen formando um triângulo, conforme preconizado por DIAZ-PIZARRO GRAF et al. (2005). O primeiro ponto marcado foi próximo, à esquerda da linha média e da cicatriz umbilical, para inserção da agulha de Veress. Em seguida, procedeu-se a injeção de CO2 a uma pressão de 8 a 12 mmHg, para promoção do pneumoperitônio. O segundo ponto marcado, destinado ao primeiro portal de acesso para cavidade 37 peritoneal, foi delimitado à esquerda da linha média, próximo ao início da prega inguinal. Foi introduzido neste local o portal de 11 mm e, através deste, o telescópio com ótica de 30º e 10 mm de diâmetro, para obtenção das imagens. O terceiro ponto marcado, destinado ao segundo portal de 5 mm, foi localizado à direita da linha média e no mesmo alinhamento do segundo portal. Através deste fez-se a inserção de pinça laparoscópica auxiliar para manipulação das estruturas e órgãos cavitários (Figura 4). FIGURA 4 - Indicação dos três pontos de inserção de instrumental para videolaparoscopia em suíno; (1) ponto de inserção da agulha de Veress; (2) ponto de inserção do telescópio com ótica de 30º; (3) ponto para inserção da pinça laparoscópica auxiliar; sítio do implante do biomaterial (setas vermelhas); no detalhe, posicionamento da cânula de 5 mm e do telescópio, cavidade peritonial insuflada e parede abdominal transiluminada. Para classificação das aderências as imagens foram registradas e armazenadas, utilizando o programa Zscan (Zscan®, Goiânia, Brasil). A análise das aderências foi realizada de acordo com escores (Quadro 1) adaptados de JIN et al.(2009). 38 QUADRO 1 - Escores para classificação das aderências peritoneais em suínos, com escala de pontuação para extensão e gravidade das aderências. Goiânia, 2013. Escore Descrição 0 1 Ausência de aderência Aderência de omento na superfície do implante (mínima sem gravidade) 2 Aderência de vísceras abdominais na superfície do implante (moderada e grave) 3 Aderência de omento e vísceras abdominais na superfície do implante (extensa e grave) Adaptado de JIN et al. (2009). Após a realização dos exames de imagem, os suínos, ainda anestesiados, foram submetidos à eutanásia por meio de dose adicional intravenosa rápida de pentobarbital sódico (25 mg/kg) seguida imediatamente de 2000 mg de cloreto de potássio 10%. A espessura total da parede abdominal da pele ao peritônio, incluindo o material implantado, foi removida imediatamente após o óbito dos animais, com a cavidade abdominal ainda insuflada e transiluminada (Figura 4, detalhe). O bloco foi fixado em formol tamponado a 10%, durante 24 horas. Posteriormente, o recorte do material foi realizado no centro e periferia do implante e os fragmentos foram mantidos por mais 24 horas no formol a 10%, lavados em água corrente e armazenados novamente em álcool a 70%. Depois foram incluídos em parafina (Histotecpastilhas® - Merck KgaA - Alemanha) para realização de cortes, com espessura de 5μm. Os fragmentos foram corados empregando hematoxilina e eosina (HE) para verificação da presença e o tipo de infiltrado inflamatório. As avaliações histológicas foram realizadas a partir de observações em cinco campos, no aumento de 200X, e correlacionadas aos escores conforme preconizado e adaptado de MELMAN et al. (2011) de acordo com o Quadro 2. O método de coloração picrossírius, indicado por MONTES & JUNQUEIRA (1991) e BORGES et al. (2007), foi utilizado para o estudo do colágeno na região do implante. As 39 lâminas foram analisadas por meio de microscópio óptico Zeiss (Carl Zeiss do Brasil Ltda., Brasil) sob luz polarizada, no aumento de 50X. A quantificação do colágeno foi realizada por meio da aplicação dos escores mostrados no Quadro 3. QUADRO 2 – Escores para determinação do grau de inflamação provocado pelo implante do compósito polipropileno-filme à base de quitosana e da tela de polipropileno, em suínos. Goiânia, 2013. Escores Polimorfonucleares Linfócitos Macrófagos Células gigantes Soma dos escores 0 0 0 0 0 1 1-5 1-5 1-5 1-2 2 6-10 6-10 6-10 3-5 3 Acima de 10 Acima de 10 Acima de 10 Acima de 5 = Resultados Escore inflamatório Soma dos escores multiplicado por 2 = individual Escore inflamatório Média de todos os escores obtidos = médio do grupo individual Adaptado de MELMAN et al. (2011). QUADRO 3 - Escores para avaliação do colágeno na região do implante junto ao compósito polipropileno-filme à base de quitosana e da tela de polipropileno, em suínos. Goiânia, 2013. Escores 0 1 2 3 Colágeno Ausência de colágeno Discreta presença de colágeno (menos de 25% do campo) Moderada presença de colágeno (26% a 50% do campo) Acentuada presença de colágeno (51% a 100% do campo) Adaptado de SILVA (2011). Os dados foram analisados com auxílio do software livre R (R Core Team, 2013). Os valores de P1 indicam comparações entre os tratamentos, os valores de P2 comparações entre os momentos, com significância estatística 40 quando P1 e P2 < 0,05. O teste de Kruskall-Wallis foi utilizado para as variáveis relacionadas aos escores. Os valores de P indicam comparações entre os grupos, com significância quando P < 0,05. RESULTADOS Os resultados da microscopia eletrônica de varredura revelaram a presença do filme à base de quitosana revestindo a tela de polipropileno e, ao mesmo tempo, obliterando os seus poros (Figura 5). FIGURA 5 – Microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos biomaterias tela de polipropileno de alta gramatura (A) x35 e (B) x55; compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana (C) x37 e (D) x140. Monofilamento de polipropileno (PP) e filme à base de quitosana (Q). Todos os suínos sobreviveram ao procedimento cirúrgico e aos 28 dias do pós-operatório sem intercorrências importantes. Ao final do experimento 41 constatou-se um ganho de peso significativo (P2 < 0,05), com peso médio de 35 kg. Não houve diferença significativa entre os grupos (P1 > 0,05), conforme pode ser observado na Tabela 1. TABELA 1- Média de peso dos suínos, realizados no grupo PP e PQ no início do experimento (M0) e 28 dias após no final (M28). Goiânia, 2013. Variável Peso Grupos Momento PP PQ M0 17,17 15,33 M28 38,17 31,83 P1 0,1118 P2 0,0001* * P < 0,05 – Valores Estatisticamente significativos. Os valores de P1 indicam comparações entre os tratamentos, os valores de P2 comparações entre os momentos. A avaliação clínica revelou no pós-operatório a presença de seroma, nos primeiros 15 dias após o implante, em 33,33% dos animais do grupo PP e 16,67% do grupo PQ. Infecção superficial da ferida cirúrgica ocorreu em 33,33% dos animais do grupo PP e em 50% do grupo PQ. Não houve extrusão dos biomateriais implantados nos dois grupos até o final do estudo. O exame de ultrassonografia direta transversal sobre a área do implante demonstrou que as referências anatômicas musculares, previamente identificadas (Figura 6), não foram observadas em 100% dos animais dos grupos avaliados aos 28 dias. Foi visto sobre a região do implante tecido em organização heterogênio com áreas hiperecóicas e pontos hipoecóicos (Figura 7 A, B, C e D). A distância média dos biomateriais, a partir da pele, foi 3,8 cm nos dois grupos (Figura 7A). Na observação das telas, o formato ondulado estava presente em 50% dos animais do grupo PP e 83,33% do grupo PQ (Figura 7A). O formato linear foi observado em 50% dos animais do grupo PP e 16,67% do grupo PQ (Figura 7B). Os dois grupos mostraram suspeitas de aderências envolvendo fígado (Figura 7C), vesícula biliar, intestino, omento ou ambos. A sutura de fixação da tela com o fio monofilamentado de polipropileno foi visível, com pouca reatividade em 33,33% dos animais do grupo PP e 16,67% do grupo PQ (Figura 7C). No grupo PQ imagem hipoecóica entre o compósito e o peritônio parietal foi observada em 83,33% dos animais (Figura 7D). 42 FIGURA 6 – Sonograma (12 MHz) em corte transversal da parede abdominal íntegra de suíno na região selecionada para o implante do biomaterial. Observa-se músculo oblíquo externo do abdome (OE), músculo Reto do abdome (R), músculo Transverso do abdome (T). FIGURA 7 - Sonograma (12 MHz) em corte transversal da parede abdominal de suíno para identificação do compósito e tela implantados. Região sobre os biomateriais com tecido em organização. (A) Formato ondulado do compósito; à direita, profundidade em cm da pele ao compósito. (B) Formato linear do compósito; em detalhe, transdutor posicionado sobre a cicatriz da ferida cirúrgica. (C) Presença do fígado aderido à tela de polipropileno (seta branca grossa); a seta fina mostra a sutura de fixação da tela. (D) Região hipoecóica sob o compósito (seta branca); vesícula biliar (VB). 43 O exame de videolaparoscopia demostrou aderências em 100% dos animais do grupo PP e 83,33% dos animais do grupo PQ. As aderências se formaram entre a superfície do material implantado e o omento maior, fígado ou ambos. Os escores predeterminados aspectos típicos indicados na Figura 8 foram aplicados em todas as imagens obtidas. Não houve diferença significativa entre os grupos testados com relação à formação de aderências (P > 0,05), conforme demonstrado na Tabela 2. Quando se comparou os resultados das avaliações de aderências da videolaparoscopia com os achados da ultrassonografia pode-se estabelecer um índice de coincidência diagnóstica de 78,57%. FIGURA 8 – Escores aplicados na avaliação das imagens obtidas durante exames de videolaparoscopia; escore 0 = ausência de aderências; escore 1 = aderência de omento; escore 2 = aderência de fígado; escore 3 = aderência de fígado e omento. 44 TABELA 2 – Resultados da comparação de escores para avaliação videolaparoscópica das aderências no grupo PP e PQ, aos 28 dias após o implante intraperitonial do compósito polipropilenofilme à base de quitosana e da tela de polipropileno. Goiânia, 2013. Grupo PP Grupo PQ P Medianas Videolaparoscopia 1,5 1 0,1202 * P < 0,05 Estatisticamente significativos. Os valores de P indicam comparações entre os grupos. A avaliação microscópica das lâminas histológicas, após 28 dias da implantação dos biomateriais, revelou respostas celulares teciduais diferentes entre os dois grupos. A resposta inflamatória total foi maior no grupo PP quando comparada a do grupo PQ (P = 0,0033). Os polimorfonucleares apresentaram-se estatisticamente aumentados numericamente na região do implante no grupo PQ (P = 0,0068), estando localizados próximos e ao longo do compósito como infiltrados. Os macrófagos e as células gigantes de corpo estranho mostraram aumento significativo (P = 0,0017) no grupo PP, próximos aos monofilamentos da tela. Os linfócitos não apresentaram diferença estatística entre os dois grupos (P = 0,9999). Estes resultados são mostrados na Tabela 3. TABELA 3 – Resultado da comparação de escores para determinação do grau de inflamação provocado pelo implante do biomaterial nos grupos polipropileno (PP) e compósito polipropileno-filme à base de quitosana PQ em suínos. Goiânia, 2013. Grupo PP Elementos avaliados Medianas Polimorfonucleares 2 3 0,0068* Linfócitos 2,5 3 0,9999 Macrófagos 3 1,5 0,0017* Células gigantes 3 0 0,0017* Escore Inflamatório 21 15 0,0033* * P < 0,05 Estatisticamente significativos. Os valores de P indicam comparações entre os grupos Grupo PQ P 45 Inflamação crônica, caracterizada por infiltrado mononuclear, com presença de macrófagos, células gigantes de corpo estranho, fibroblastos e colágeno foi observada no grupo PP junto aos monofilamentos de polipropileno (Figura 09). Na avaliação do tecido do grupo PQ observou-se uma camada de infiltrado predominantemente constituída por polimorfonucleares ao longo do compósito e próximos a fragmentos do filme de quitosana. Não foram observados os monofilamentos de polipropileno junto ao tecido conjuntivo frouxo subjacente (Figura 10). No grupo PQ o colágeno tipo I (maduro), de cor alaranjada, apresentou-se distante do compósito separado por uma região menos intensa, de coloração esverdeada, caracterizando o colágeno tipo III (imaturo) (Figura 11 A). A coloração alaranjada, característica do colágeno tipo I, predominou no grupo PP em toda a extensão do tecido, se infiltrando entre os monofilamentos de polipropileno (Figura 11 B). A observação do colágeno após a coloração picrossírius demonstrou uma discrepância estatística, entre os dois grupos (P = 0,0154) para o colágeno tipo I e para o colágeno total (P = 0,0037), conforme Tabela 4. TABELA 4 - Resultado da comparação de escores para avaliação da qualidade do colágeno, realizada no grupo PP e PQ, aos 28 dias após implante intraperitonial do compósito polipropileno-filme à base de quitosana e da tela de polipropileno Goiânia, 2013. Grupo PP Grupo PQ P Mediana Colágeno tipo I 2,5 1 0,0154* Colágeno tipo III 1,5 1 0,3173 Colágeno total 2,5 1 0,0037* * P < 0,05 Estatisticamente significativos. Os valores de P indicam comparações entre os grupos 46 FIGURA 09 - Fotomicrografias de fragmentos do tecido da parede abdominal de suíno integrada aos monofilamentos da tela de polipropileno 28 dias após o implante (HE, 200X e 400X). Tecido conjuntivo frouxo (TCF). Células gigantes de corpo estranho (setas). Infiltrado mononuclear (MN). Região ocupada pelo monofilamento da tela (PP). FIGURA 10 - Fotomicrografias de fragmentos do tecido da parede abdominal de suíno aos 28 dias após a implantação do compósito (Coloração HE). (A) 100X, (B) 200X e (C e D) 400X. Tecido conjuntivo frouxo (TCF). Infiltrado Polimorfonuclear (PMN). Lacuna ocupada pelo compósito (LOC). Fragmentos do filme de quitosana (Q). 47 FIGURA 11 - Fotomicrografias de tecidos dos grupos PQ e PP aos 28 dias após a implantação dos biomateriais sobre luz polarizada. Coloração picrossírius com aumento de 50X. A) Lâmina do grupo PQ. B) Lâmina do grupo PP. (Q) Fragmentos do filme de quitosana. (PP) monofilamentos da tela de polipropileno. (INF) Infiltrado inflamatório. (COL) Colágeno. DISCUSSÃO O estudo aqui desenvolvido comprovou que os suínos são bons modelos experimentais para pesquisas relacionadas à parede abdominal. Conforme HUBER et al. (2012) esta espécie animal é a segunda mais utilizada nos estudos para implantação de telas para o reparo de tecidos moles. Considerando que todo procedimento cirúrgico determina certo grau de estresse, o que pode refletir na diminuição do ganho de peso, pode-se inferir que as condições pós-operatórias a que os animais foram submetidos foram adequadas, já que houve um ganho ponderal significativo entre os dois momentos. O seroma, visível clinicamente nos primeiros 15 dias, em dois animais do grupo PP e um do grupo PQ foi relacionado à ressecção dos planos musculares abdominais, o que promoveu a criação de um distanciamento entre a a pele e a prótese conforme também citado por MIHĂILESCU et. al., (2012). Outro fator que pode ter sido determinante na formação do seroma foi a reação inflamatória local do hospedeiro, também considerada por esse autor. O achado de seroma no grupo PP, proporcionalmente superior ao PQ, contraria o relato de AMID (1997). Segundo o autor, o rápido preenchimento por tecido conjuntivo dos 48 poros minimiza a formação de seromas. Não foi necessária a drenagem do líquido, que desapareceu espontaneamente em 15 dias conforme observado por VILAR et.al. (2011) em cabras e citado por PARRA et al. (2004) em humanos. A importância da ultrassonografia para detecção de alterações relacionadas à implantação das telas pode ser confirmada neste estudo, uma vez que ficou evidente a ocorrência de dois tipos de complicações descritas após a implantação da tela: a deformação da tela, caracterizada por uma imagem ondulada, e o afastamento do compósito dos tecidos adjacentes, caracterizado por imagem hipoecóica entre os mesmos. Estes achados podem determinar a falha dos procedimentos de reparação da parede abdominal, conforme salientado por AMID (1997) e JAMADAR et al. (2008). A combinação das telas de polipropileno com um biomaterial absorvível pode proporcionar uma melhora do seu manuseio operatório tornando-a mais flexível, sendo esta uma característica benéfica como citado por PATEL et al. (2012). Esta característica pode reduzir o desconforto pós-operatório. No presente estudo observou-se que o compósito formado pela tela de polipropileno, associada ao filme espesso 2QM, apresentou flexibilidade limitada mesmo após sua prévia hidratação antes do implante, contudo, não impediu sua implantação. A relevância da ultrassonografia foi marcante para o estudo da parede abdominal normal dos suínos, possibilitando a evidenciação das camadas musculares e bainhas constituintes. Imagens claras também foram já evidenciadas em humanos por RANKIN et al. (2006), MOKINI et al. (2011) e HERRING et al. (2012) nos seus estudos em paredes abdominais íntegras. Os achados de aderências pelo exame de videolaparoscopia na totalidade dos animais do grupo PP evidenciou a afirmação que as aderências às vísceras abdominais são geralmente causa de dor, desconforto e complicações pós-cirúrgica. É sabido que as telas de polipropileno quando implantadas intraperitonialmente são adesiogênicas, como salientado por BELLON et al. (2001) e SAHIN et al. (2007). As aderências omentais nesse trabalho prevaleceram com maior incidência nas bordas do implante onde foi aplicada a sutura de fixação das próteses. Foram ainda encontradas aderências hepáticas, o que pode ser atribuído ao posicionamento anatômico do órgão do lado direito do abdome, 49 coincidente com localização do implante do biomaterial na parede abdominal. Sistemas de barreira são avaliados constantemente com o objetivo de impedir o contato direto da tela com o peritônio, reduzindo assim, a formação das aderências. No trabalho de PAULO et al. (2009) o sistema avaliado foi um filme à base de quitosana, suturado na face peritonial da tela, exibindo resultado favorável à não formação de aderências, excetuando-se àquelas do omento maior sobre a zona de sutura similarmente como encontrado também por SCHUGPASS et al. (2009). Após uma lesão peritoneal ocorre exsudação que leva à formação da matriz de fibrina. Posteriormente esta matriz se organiza gradualmente e é substituída por um tecido que contém fibroblastos macrófagos e célula gigantes, interconectando as duas superfícies peritoniais lesadas. Os fibroblastos contribuem com a deposição de colágeno e também estabilizam e organizam os feixes de fibrina resultando na persistência das aderências conforme relatado por CHEONG et al. (2001). Com base nesse mecanismo supõe-se que a ação da quitosana está relacionada à inibição dos fibroblastos com consequente diminuição da produção de aderências no sitio do implante. Esta inibição deve ocorrer dentro de duas semanas, a partir desse período a barreira se torna desnecessária no local, devendo a mesma ser biodegradada, conforme relatado por ZHOU et al. (2007). O filme 2QM de quitosana não foi completamente degradado até os 28 dias, como foi evidenciado pelos exames histológicos do material coletado. O filme à base de quitosana, por sua característica densa, serviu de barreira mecânica junto aos poros da tela de polipropileno, impedindo a migração das células como sugerido por WEYHE et al. (2006) e PATEL et al. (2012). A relevância do tamanho dos poros para implantação de biomaterial é expressa pela observação de que em casos de poros pequenos, o granuloma circunda a fibra do polímero e a cicatriz se forma distante do material, levando a formação da placa de cicatriz, o que não propicia espaço para o crescimento tecidual e a consequente incorporação do material. Esta informação de JUNGE et al. (2012) justifica a ausência de incorporação dos compósitos do grupo PQ. A dinâmica da infiltração celular durante o processo de recuperação peritoneal envolve o surgimento inicial de polimorfonucleares, que devem persistir 50 por 1 a 2 dias no local. Esta é uma resposta tecidual normal, como citado por DIZEREGA & CAMPEAU (2001) e XIA & TRIFFITT (2006). A resposta inflamatória crônica característica nos implantes de telas começa quando os monócitos e linfócitos são reconhecidos no sítio do implante. Esses eventos esperados foram claramente visibilizados no grupo PP. O grupo PQ exibiu uma resposta atípica, caracterizada pelo influxo tardio e constante de polimorfonucleares no local, o que pode ser justificado pelas alterações adicionais promovidas pelo material, já que, presenças de fragmentos do filme à base de quitosana ainda estavam presentes aos 28 dias. Esse fato mudou o quadro de formação do granuloma, o que estaria provavelmente relacionado à migração de outros tipos de leucócitos não comuns ao granuloma como citado por ADAMS (1976). As fibras colágenas são as maiores constituintes da matriz extracelular, e atuam como componente estrutural das superfícies externas e internas do corpo. Também compõem o parênquima de todos os órgãos. As fibras colágenas são necessárias para os mecanismos de regeneração e reparação tecidual. Esta informação de SILVER (2009) permite estabelecer a importância do colágeno para incorporação das próteses. A qualidade do tecido conectivo é determinada pela quantidade e relação de síntese do colágeno tipo I e tipo III, sendo o tipo I maduro encontrado no tecido conjuntivo denso. O tipo III imaturo predomina nos estágios iniciais da cicatrização, devendo existir uma maior proporção do colágeno tipo I em relação ao colágeno tipo III, conforme relatou JUNGE et al. (2004). Esta relação foi avaliada na comparação entre os grupos, mostrando que o grupo PQ apresentou relação colágeno I/III diminuída, o que representa um tecido conjuntivo imaturo capaz de acarretar a redução da sua força ténsil. CONCLUSÃO O compósito tela de polipropileno-filme à base de quitosana 2QM não impediu totalmente a formação de aderências. Os achados de aderências obtidos da ultrassonografia direta foram coincidentes, em sua maioria, com os da videolaparoscopia. 51 REFERÊNCIAS 1. ADAMS, D. O. 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No presente estudo ficou evidenciada a importância multidisciplinar das pesquisas de biomateriais. A engenharia se ocupa dos aspectos físicos e químicos dos materiais, mas precisa associa-los às respostas biológicas do hospedeiro, que nem sempre são previsíveis, como no caso de cálculos matemáticos. Existe então a necessidade do conhecimento das áreas médicas. O contrário também é verdadeiro. A quitosana, por se tratar de uma fibra abundante na natureza, é promissora nas pesquisas médicas, tanto utilizada de forma isolada ou associada a outros materiais. Por ser facilmente encontrada permite um custo razoável para produção de biomaterias. Para sua utilização, no entanto, em compósitos destinados a reparação da parede abdominal e prevenção de aderências, pesquisas adicionais devem continuar a serem desenvolvidas. O estudo técnico pode ajudar a responder: Qual deve ser a espessura máxima do filme à base de quitosana? Qual o arranjo espacial do compósito deve ser o ideal para manter os poros livres? Qual o tempo exato da degradação do filme? 58 ANEXOS Documento de aprovação do COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA 59 Escores utilizados no experimento para comparação da inflamação entre os grupos. Escores utilizados para comparação da videolaparoscopia e avaliação do colágeno. animal 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 grupo 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 Escores video Escore Colágeno total Escore Colágeno tipo I Escore Colágeno tipo III 3 3 3 1 1 3 3 1 1 2 2 1 2 3 3 2 3 2 2 1 2 3 3 1 1 0 1 1 1 3 1 2 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 60 Resultados individuais do leucograma e provas bioquímicas.