Desenvolvimento de métodos moleculares para detecção simultânea de fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, fusarium solani e curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens

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dc.contributor.advisor-co1Wendland, Adriane
dc.contributor.advisor-co1Latteshttp://lattes.cnpq.br/7196405181790361eng
dc.contributor.advisor1Lobo Junior, Murillo
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/3352833548668460eng
dc.contributor.referee1Lobo Junior, Murillo
dc.contributor.referee2Wendland, Adriane
dc.contributor.referee3Cunha, Marcos Gomes da
dc.contributor.referee4Coelho, Regina Sartori
dc.creatorOliveira, Maythsulene Inácio de Sousa
dc.creator.Latteshttp://lattes.cnpq.br/3165674152485380eng
dc.date.accessioned2018-08-02T11:09:15Z
dc.date.issued2015-04-11
dc.description.abstractCommon bean (Phaseolus vulgaris L.) is grown in Brazil in three different cropping seasons, and in diverse agroecosystems. In such different environments, the crop is exposed to several constraints responsible for yield losses, such as pathogenic organisms. Among common bean relevant diseases, fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli), dry root-rot (Fusarium solani) and Curtobacterium wilt (Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) have similar symptoms, hindering diagnosis in the field, and whose identification in seed health testing is also limited. In both cases, identification at species level is an important step to manage this root pathogen complex, whose detection can be improved by molecular biology tools. Therefore, this study aimed to: 1) to develop and validate a multiplex PCR (m-PCR) method for simultaneous identification of three common bean pathogens, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F. solani and C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; and 2) develop an isothermal amplification of DNA (LAMP) method to detect of F. oxysporum f. sp. phaseoli on seeds. M-PCR method was developed for identification of isolated colonies, as well as infected seeds. In seeds, total DNA was obtained by alkaline lysis method, which inactivates nucleases during the extraction process. M-PCR allowed the identification of all pathogens, with detection of C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, F. oxysporum f. sp. phaseoli and F. solani amplicons in agarose gel with respectively 306, 609 and 143 base pairs. Furthermore, m-PCR also reduced costs and time to detect Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli from 10 days to three hours. It was not possible to develop an optimized protocol for detection of F. oxysporum f. sp. phaseoli by the LAMP method, using only the tf1 gene for design of primers, since such primers were functional only for amplifying large amounts of target DNA. Based on the negative results with LAMP, it is suggested that further studies should be performed using other DNA sequences available in GenBank database.eng
dc.description.provenanceSubmitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2018-08-01T17:33:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maythsulene Inácio de Sousa Oliveira - 2015.pdf: 3135445 bytes, checksum: a08e11c7f2df635f3ff7726cfde58f49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)eng
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dc.description.resumoO feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) é cultivado durante todo o ano no território brasileiro, em três épocas distintas e em vários agroecosistemas. Nestes ambientes distintos, a cultura está exposta a diversos fatores que causam perdas de rendimento, como o ataque de patógenos. Dentre as doenças do feijoeiro-comum encontram-se a murcha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli), a podridão-radicular-seca (Fusarium solani) e a murcha-de-curtobacterium (Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) que apresentam sintomas semelhantes, dificultando seu diagnóstico no campo, e cuja identificação em testes de sanidade de sementes também é limitada. Em ambos os casos, a identificação em nível de espécie é uma importante etapa do manejo deste complexo de patógenos, cuja detecção pode ser aperfeiçoada com a adoção de ferramentas de biologia molecular. Portanto, este estudo teve como objetivos: 1) Desenvolver e validar um método de multiplex PCR (m-PCR) para identificação simultânea de três espécies de patógenos do feijoeiro-comum, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F. solani e C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; e 2) desenvolver a técnica de amplificação isotérmica de DNA (LAMP) para detecção de F. oxysporum f. sp. phaseoli em sementes. O método de m-PCR foi desenvolvido para identificação de colônias isoladas bem como sementes infectadas. Nas sementes, o DNA total foi obtido pela lise alcalina, método que inativa nucleases durante o processo de extração. A m-PCR possibilitou a identificação de todos os patógenos, com detecção de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, F. oxysporum f. sp. phaseoli e F. solani em bandas formadas em gel de agarose respectivamente com 306, 609 e 143 pares de base. Além disso, a extração do DNA total das sementes pela lise alcalina em combinação com a m-PCR também possibilitou redução de custos e tempo de realização do diagnóstico de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, de 10 dias para três horas. Não foi possível estabelecer um protocolo otimizado para detecção de F. oxysporum f. sp. phaseoli pelo método LAMP, utilizando somente o gene tf1 para desenho dos iniciadores, uma vez que, os iniciadores revelaram-se funcionais apenas para a amplificação com grandes quantidades de DNA alvo. Diante dos resultados obtidos com LAMP, sugere-se que estudos posteriores sejam realizados empregando outras sequências de DNA disponíveis no banco de dados GenBank.eng
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESeng
dc.formatapplication/pdf*
dc.identifier.citationOLIVEIRA, Maythsulene Inácio de Sousa. Desenvolvimento de métodos moleculares para detecção simultânea de fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, fusarium solani e curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens. 2015. 78 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2015.eng
dc.identifier.urihttp://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/8762
dc.languageporeng
dc.publisherUniversidade Federal de Goiáseng
dc.publisher.countryBrasileng
dc.publisher.departmentEscola de Agronomia - EA (RG)eng
dc.publisher.initialsUFGeng
dc.publisher.programPrograma de Pós-graduação em Agronomia (EA)eng
dc.rightsAcesso Aberto
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectAmplificação isotérmica do DNApor
dc.subjectMultiplex-PCRpor
dc.subjectPhaseolus vulgaris L.por
dc.subjectMurcha-de-fusariumpor
dc.subjectPodridão-radicular-secapor
dc.subjectMurcha-de-curtobacteriumpor
dc.subjectDNA isothermal amplificationeng
dc.subjectMultiplex-PCReng
dc.subjectPhaseolus vulgaris L.eng
dc.subjectFusarium wilteng
dc.subjectRoot rot dryeng
dc.subjectWilt bacterial wilteng
dc.subject.cnpqAGRONOMIA::FITOSSANIDADEeng
dc.titleDesenvolvimento de métodos moleculares para detecção simultânea de fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, fusarium solani e curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfacienseng
dc.title.alternativeDevelopment of molecular methods for simultaneous detection of fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, fusarium solani e curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfacienseng
dc.typeDissertaçãoeng

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