Microdispositivo de poliestireno-toner rotacionalmente controlado por um hand-spinner e aplicações no diagnóstico molecular de doenças infecciosas

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dc.contributor.advisor1Duarte, Gabriela Rodrigues Mendes
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/9005971441891787pt_BR
dc.contributor.referee1Duarte, Gabriela Rodrigues Mendes
dc.contributor.referee2Chaves, Andrea Rodrigues
dc.contributor.referee3Coltro, Wendell Karlos Tomazelli
dc.contributor.referee4Bailão, Alexandre Melo
dc.creatorOliveira, Kézia Gomes de
dc.creator.Latteshttp://lattes.cnpq.br/7958404744770361pt_BR
dc.date.accessioned2022-08-12T12:50:22Z
dc.date.available2022-08-12T12:50:22Z
dc.date.issued2022-04-14
dc.description.abstractInfections caused by the new coronavirus (SARS-CoV-2) and arthropod-borne viral infections such as dengue, zika and chikungunya have become a severe public health problem. As all diseases have a significant social impact, the accurate and rapid diagnosis of the infection can be instrumental in treating and adequately controlling the disease. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) emerged in 2000 as an essential alternative to simplify the diagnostics of infectious diseases. An advantage of LAMP is that it allows a straightforward reading of the final result through visual detection. However, this step must be performed with caution to avoid contamination and false-positive results, especially in cases where there is a need to open the tube. In this sense, LAMP performed on microfluidic platforms can minimize false-positive results and have potential for point-of-care applications. Here, we describe a polystyrene (PS-T) centrifugal microfluidic device manually controlled by a hand-spinner for molecular diagnosis of COVID-19, dengue, zika and chikungunya by RT-LAMP, with integrated and automated colorimetric detection. The confirmatory and discriminatory on-chip RT-LAMP test was performed with two types of detection: i) automated addition of SYBR Green fluorescent dye post-amplification (RT-LAMP-SG), and ii) addition of the pH indicator, cresol red, pre-incubation (RT-LAMP-CR). RT-LAMP-SG amplification was performed in a microchamber with a capacity of 5 μL, and the SG was inserted in another chamber with a 3 μL. The reaction was thermally controlled with a thermoblock. At the end of the incubation time (10 min), the detection was performed directly on the device by visual detection after the microdevice spun with a hand-spinner. Our results for the endpoint detection system for LAMP (RT-LAMP-SG) demonstrate that it is possible to detect SARS-CoV-2, DENV-1, ZIKV and CHIKV in the microdevices with a detection limit of approximately 10-3, 660, 30 and 48 RNA copies μL-1 respectively. Clinical samples of patients infected with COVID-19 were tested using our RT-LAMP protocol as well as by conventional RT-qPCR, demonstrating comparable performance to the CDC SARS-CoV-2 RT-qPCR assay. For the RT-LAMP-CR amplification, only the detection of arboviruses was evaluated and presented a detection limit of 1050, 15 and 72.5 copies per μL for detecting DENV-1, ZIKV and CHIKV, respectively. Devices in CD setup were successfully handled performing the three tests simultaneously (dengue, zika and chikungunya) for both detection methods (RT-LAMP-SG and RT-LAMP-CR). The methodologies designated in this study represent simple methods for rapid molecular diagnostics of infectious viral diseases on disposable microdevices, ideal for point-of-care test (POCT) systems.eng
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dc.description.resumoEm muitos lugares ao redor do mundo, infecções virais transmitidas por artrópodes como a dengue, zika e chikungunya e infecções virais respiratórias, tal como o SARS-CoV-2 (síndrome respiratória aguda grave de coronavírus 2) tornou-se um grave problema de saúde pública. Assim como para todas as doenças de grande impacto social, o diagnóstico preciso e rápido da infecção, pode ser um grande aliado no tratamento e controle adequado da doença. A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) emergiu no ano 2000 como uma importante alternativa para simplificar o diagnóstico de doenças infecciosas. Além disso, uma vantagem da LAMP é que ela permite uma leitura fácil do resultado através da detecção visual. No entanto, esta etapa deve ser realizada com cautela para evitar contaminação e resultados falso-positivos, especialmente nos casos em que há necessidade de abrir o tubo ao final da reação. Neste sentido, a LAMP realizada em plataformas microfluidicas pode minimizar resultados falso-positivos, além de ter potencial para aplicações no point-of-care. Neste estudo, descrevemos dispositivos microfluídicos centrífugos de poliestireno (PS-T) controlados por hand-spinner para diagnóstico molecular da COVID-19, dengue, zika e chikungunya por RT-LAMP, com detecção colorimétrica integrada e automatizada. Os testes RT-LAMP on-chip foram realizados com dois tipos de detecção diferentes: i) adição automatizada de SYBR Green pós-amplificação (RT-LAMP-SG), ii) e adição do indicador de pH, vermelho de cresol, pré-incubação (RT-LAMP-VC). A amplificação no teste RT-LAMP-SG foi realizada em uma microcâmara com capacidade de 5 μL e o SG foi adicionado em outra câmara com capacidade para 3 μL, e a reação foi controlada termicamente com um termobloco. Ao final do tempo de incubação (10 min), a detecção foi realizada diretamente no dispositivo por detecção visual após rotação do dispositivo por um hand-spinner. Nossos resultados para os testes com detecção via SYBR Green I demonstram que é possível detectar com sucesso SARS-CoV-2, DENV-1, ZIKV e CHIKV nos microdispositivos e o limite de detecção foi de aproximadamente 10-3 , 660, 30 e 48 cópias do RNA μL-1 respectivamente. Amostras clínicas de COVID-19 foram testadas utilizando o protocolo RT-LAMP-SG, bem como pelo RT-qPCR, demonstrando desempenho comparável ao ensaio CDC para detecção do SARS-CoV-2 RT-qPCR. Para a amplificação RT-LAMP-VC apenas a detecção de arboviroses foi avaliada e apresentou limite de detecção de 1050, 15 e 72,5 cópias μL-1 para detecção do DENV-1, ZIKV e CHIKV, respectivamente. Dispositivos em formato de CD foram utilizados com sucesso para realização dos três testes simultaneamente (dengue, zika e chikungunya) para ambos os métodos de detecção (RT-LAMP-SG e RT-LAMP-VC). As metodologias descritas neste estudo representam métodos simples, utilizadas aqui para diagnósticos moleculares rápidos de doenças virais infecciosas em microdispositivos descartáveis, ideais para sistemas de teste no point-of-care.pt_BR
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESpt_BR
dc.description.sponsorshipFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiáspt_BR
dc.identifier.citationOLIVEIRA, K. G. Microdispositivo de poliestireno-toner rotacionalmente controlado por um hand-spinner e aplicações no diagnóstico molecular de doenças infecciosas. 2022. 194 f. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2022.pt_BR
dc.identifier.urihttp://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/12256
dc.languageporpt_BR
dc.publisherUniversidade Federal de Goiáspt_BR
dc.publisher.countryBrasilpt_BR
dc.publisher.departmentInstituto de Química - IQ (RG)pt_BR
dc.publisher.initialsUFGpt_BR
dc.publisher.programPrograma de Pós-graduação em Química (IQ)pt_BR
dc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/*
dc.subjectRT-LAMPpor
dc.subjectMicrodispositivos de PS-Tpor
dc.subjectVálvulas hidrofóbicas de tonerpor
dc.subjectHand-spinnerpor
dc.subjectPS-T microdeviceseng
dc.subjectHydrophobic toner valveseng
dc.subject.cnpqCIENCIAS EXATAS E DA TERRA::QUIMICA::QUIMICA ANALITICA::ELETROANALITICApt_BR
dc.titleMicrodispositivo de poliestireno-toner rotacionalmente controlado por um hand-spinner e aplicações no diagnóstico molecular de doenças infecciosaspt_BR
dc.title.alternativePolystyrene-toner microdevice rotationally controlled by a hand-spinner and applications in the molecular diagnosis of diseases infectiouseng
dc.typeTesept_BR

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