UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MECANISMO DE MORTE CELULAR INDUZIDA POR COMPLEXOS DE RUTÊNIO II E III EM DIFERENTES LINHAGENS TUMORAIS FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA Goiânia 2014 FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA MECANISMO DE MORTE CELULAR INDUZIDA POR COMPLEXOS DE RUTÊNIO II E III EM DIFERENTES LINHAGENS TUMORAIS Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicasdo Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas. Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular Orientadora: Prof. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda. Goiânia 2014 FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA MECANISMO DE MORTE CELULAR INDUZIDA POR COMPLEXOS DE RUTÊNIO II E III EM DIFERENTES LINHAGENS TUMORAIS BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO Aluna: FLÁVIA DE CASTRO PEREIRA Orientadora: Profa. Dra. ELISÂNGELA DE PAULA SILVEIRA LACERDA Membros: 1. Profa. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda - UFG 2. Prof. Dr. Wagner dos Santos Gouvêa - UFG 3. Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck - USP 4. Profa. Dra. Yandra Lobato - UFG 5. Prof. Dr. Cláudio Carlos da Silva - UCG ou 6. Profa. Dra. Aliny Pereira de Lima - UFG 7. Prof. Dr. Carlos Henrique Castro - UFG Aprovada em: 19/03/2014 “Dizem que a vida é para quem sabe viver, mas ninguém nasce pronto. A vida é para quem é corajoso o suficiente para se arriscar e humilde o bastante para aprender.” Clarise Lispector DEDICATÓRIA Aos meus pais, Maria Francisca e Orlando, exemplo de coragem, vida e amor. Obrigada pelo incentivo, compreensão, amor, dedicação, orações em todos os momentos da minha vida. A vocês o meu eterno amor. Ao meu amado noivo Wendell, pelo amor, amizade, dedicação, carinho, compreensão e incentivo. Pelo exemplo de alegria na busca de seus objetivos. Por todos os sentimentos que cultivamos ao longo desses anos. Obrigada por inundar meu coração com a maior felicidade de toda a minha vida, nosso filho! Ao meu irmão, Patrick por sempre estar presente em minha vida. AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço a Deus por mais esta etapa de aprendizagem em minha vida, mas, acima de tudo, agradeço por sempre ter me colocado no caminho certo, por nunca me deixar enfraquecer meio às adversidades. Agradeço a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho e, em especial, A minha Orientadora Prof. Dra. Elisângela de Paula Silveira Lacerda, exemplo de pesquisadora a ser seguido, a quem dedico admiração e respeito. Alguém que me ensinou grandes lições sobre a conduta profissional e pessoal. A quem tenho profunda admiração, respeito e grande carinho. Muito do que sou, devo a você, obrigada por estar sempre presente e, o mais importante, obrigada por acreditar em mim. Ao Prof. Dr. Alzir Bastista Azevedo e sua equipe do laboratório de Química da Universidade da Federal de São Carlos, pela síntese e fornecimento do composto de Rutênio inédito para a realização deste trabalho. Agradeço a Aliny pela grande amizade, dedicação, ajuda e, principalmente, pelo companheirismo. Agradeço a Wanessa pela amizade, compreensão e carinho em todos esses anos de convivêcia. Agradeço a Lorena, pela a oportunidade de ser sua amiga e por todo o carinho a mim dedicado. A equipe do Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, em especial a Francyelli , Thalita, Alessandra, Hugo, Sônia, Lucas, Raquel, Kézia e Patríca obrigada pela confiança, pela grande ajuda prestada durante todos esses anos e, acima de tudo, pela amizade. Aos funcionários da Universidade, pelo auxílio e compreensão no decorrer da pesquisa. Ao Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás pela estrutura didática e técnica para a realização dos estudos e trabalhos do doutorado. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), pela bolsa de estudos. A toda a minha família pelo incentivo. À banca examinadora que, gentilmente, aceitou o convite para participar da defesa desta tese. A todas as pessoas que verdadeiramente torceram por mim, incentivaram-me e que hoje comemoram comigo esta conquista. SUMÁRIO Lista de Abreviaturas e Siglas................................................................................xii Lista de Figuras - INTRODUÇÃO .........................................................................xvi Lista de Tabelas - INTRODUÇÃO .........................................................................xvii Lista de Figuras e Tabelas do Artigo 1 ................................................................xviii Lista de Figuras e Tabelas do Artigo 2 ................................................................xix Anexos ...................................................................................................................xxi Resumo ..................................................................................................................xxii Abstract ..................................................................................................................xxiii 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 25 1.1. Câncer ................................................................................................................ 25 1.2. Ciclo celular e fármacos quimioterápicos ........................................................... 26 1.3. Tipos de Morte celular ........................................................................................ 31 1.4. Apoptose ............................................................................................................ 36 1.5. Compostos baseados em metal usados na terapia antitumral ........................... 42 1.6. Complexos de Rutênio e seu Mecanismo de Ação ............................................ 45 1.7. Complexos de Rutênio (II) ................................................................................. 52 2. JUSTIFICATIVA.................................................................................................... 55 3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 57 3.1. Objetivo Geral .................................................................................................... 57 3.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 57 4. METODOLOGIA ................................................................................................... 58 4.1. Síntese dos Compostos de Rutênio ................................................................... 58 4.2. Droga antitumoral controle ................................................................................. 59 4.3. Preparação dos compostos de Rutênio para ensaios biológicos in vitro ............ 59 4.4. Meio de cultura celular ....................................................................................... 60 4.5. Linhagens celulares tumorais e normais ............................................................ 60 4.6. Cultura de células tumorais ................................................................................ 60 4.7. Método de redução do tetrazólio (Teste MTT) ................................................... 61 4.8. Ensaio de citotoxicidade pela técnica de Azul de Tripan .................................... 62 4.9. Eletroforese em gel de agarose ......................................................................... 62 4.10. Ensaio Cometa ................................................................................................. 63 4.11. Análise da Cinética do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo .......................... 64 4.12. Avaliação de apoptose e necrose por coloração com Anexina V/PI ................ 65 4.13. Análise Bcl-2 por citometria de fluxo ................................................................ 66 4.14. Análises da ativação de caspases pelo ensaio colorimétrico ........................... 66 4.15. Ensaio do potencial de membrana mitocondrial JC-1 ...................................... 67 4.16. Avaliação da expressão gênica ........................................................................ 67 4.16.1 Extração RNA ...................................................................................... 67 4.16.2 Síntese cDNA ...................................................................................... 68 4.16.3 Real time PCR (qPCR) ........................................................................ 68 4.17. Análise Estatística ............................................................................................ 70 5. PRODUÇÃO CIENTÍFICA .................................................................................... 71 5.1. ARTIGO 1 .......................................................................................................... 71 Cytotoxic effects of the compound cis-tetraammine(oxalato)ruthenium(III) dithionate on k562 human erythroleukemia cells ....................................................................... 72 Abstract ..................................................................................................................... 73 1.Introduction............................................................................................................. 74 2.Results ................................................................................................................... 76 2.1 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound reduces viability of K562 cells ..... 76 2.2. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound presents cytotoxic activity towards K562 tumor cell lines ................................................................................................. 77 2.3. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) induced apoptosis in K562 cells as verified by DNA ladder analysis .................................................................................................. 78 2.4 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) presents genotoxic effects against K562 tumor cells ........................................................................................................................... 78 2.5 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) increased the number of K562 tumor cells in sub-G1 phase, an indicative of apoptosis .................................................................. 79 3. Discussion ............................................................................................................. 81 4. Material and methods ............................................................................................ 85 4.1. Synthesis of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)........................................................... 85 4.2. Cell culture ......................................................................................................... 86 4.3. Cell Citotoxicity (Trypan blue staining) ............................................................... 86 4.4. Viability assay..................................................................................................... 87 4.5. DNA laddering assay .......................................................................................... 88 4.6. Comet Assay ...................................................................................................... 88 4.7. Cell Cycle Analysis by flow cytometry ................................................................ 89 4.8. Statistical analysis .............................................................................................. 90 Acknowledgments ..................................................................................................... 90 REFERENCES .......................................................................................................... 91 5.2. ARTIGO 2 .......................................................................................................... 98 Ruthenium [RuCl(bcn)(N-N)(P-P)]PF6 complexes: In vitro pre-clinical trials and a potential metallodrug against sarcoma S180 tumor cells .......................................... 98 ABSTRACT ............................................................................................................... 99 Introduction..............................................................................................................101 Material and Methods ..............................................................................................101 Chemicals................................................................................................................101 Synthesis .................................................................................................................102 Microanalysis for [RuCl(bCN)(bipy)(dppe)]PF6.2H2O: C% (calc) 52.98/52.96; H%, 4.53/4,23; N%, 4.19/4.30 .........................................................................................102 Apparatus ................................................................................................................103 X-ray crystallography ...............................................................................................103 Cell Culture..............................................................................................................104 Cytotoxicity assays ..................................................................................................105 Analyzing the cell cycle by flow cytometry ...............................................................105 Detecting apoptosis by using the annexin V binding assay .....................................106 Evaluating mitochondrial membrane potential (∆Ψm) ..............................................106 Assaying caspase-3, 8 and 9 activity ......................................................................107 Analyzing Bcl-2 by flow cytometry ...........................................................................107 Total RNA extraction and cDNA synthesis ..............................................................108 Real-time quantitative PCR .....................................................................................108 Statistical Analysis ...................................................................................................109 Results and discussion ............................................................................................109 Cytotoxicity assay ....................................................................................................110 Analyzing the cell cycle by flow cytometry ...............................................................111 Detecting apoptosis by using the Annexin V binding assay ....................................113 Mitochondrial potential – JC - 1 ...............................................................................114 Bcl-2 Analysis by flow cytometry .............................................................................116 Colorimetric caspase test ........................................................................................117 Real-time Quantitative PCR ....................................................................................118 Conclusions .............................................................................................................120 Highlights.................................................................................................................120 References ..............................................................................................................122 6. CONCLUSÕES ...................................................................................................129 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................131 8. CONTRIBUIÇÕES EM OUTROS PROJETOS ...................................................133 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................134 10. ANEXOS ...........................................................................................................150 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS µM – Micromolar µL – Microlitro 2 – Teste do Qui-quadrado a.C. – Antes de Cristo A-20 - Linhagem de células de Linfoma de camundongo A2780 - Câncer de ovário humano A498 - Câncer renal ACS - A American Cancer Society AIF - Fator Indutor de Apoptose APAF-1 - Protease Apoptótica Ativadora de Fator 1 ATCC – American Type Culture Collection ATP – Adenosina trifosfato BAK - Proteína pró-apoptótica BAX - Proteína X associada ao Bcl2 BCL2 - Proteína antiapoptótica (Linfoma células B) BCLX - Proteína antiapoptótica BD – Bioscience Parmingen BID - Domínio de Morte de Interação com BH3 BIM - Proteína pró-apoptótico BSA – Protein Bovine serum albumin (Proteína albumina de soro bovino) Ca2+ – Cálcio CCNS – Quimioterápicos clico-celular não específico CCS – Quimioterápicos ciclo-celular específico CD95 - Ligante de Receptor de Morte Celular CDK – Proteína quinase dependente de ciclina CDK4 – Quinase dependente de ciclina 4 CDKs – Proteínas quinases dependente de ciclina Ciclina D – Proteína membro da família das ciclinas Citocromo C – Proteína heme associada à membrana externa da mitocôndria CKIS – Inibidores de Quinase-Ciclina CPCNP – Câncer de pulmão de células não-pequenas CPCP – Câncer de pulmão de células pequenas D. melanogaster – Drosophila melanogaster DAPK - Proteína Quinase serina/treonina Associada à Morte DCC - Deleção Carcinoma Coloretal DCNTs – Comissão de Nomenclatura de Morte Celular DIABLO - Inibidor Direto de Proteínas Inibidoras de Apoptose DISC - Complexo de sinalização de indução de morte DMEN – Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO – Dimetilsulfóxido DNA – Ácido desoxirribonucléico DO – Densidade óptica E. coli – Escherichia coli ER – Retículo Endoplasmático EVSA-T - câncer de mama FADD - Domínio de Morte FAS-associada FAS – Receptor de superfície envolvido na ativação da apoptose FASL/CD95 – Receptor de superfície envolvido na ativação da apoptose FDA – Food and Drug Administration FITC – Fluorescein thiocyanate (Fluoresceína tiocianato) GAP1 – Fase G1 – Ciclo celular GAP2 – Fase G2 – Ciclo celular H266 – Linhagem Câncer de pulmão HCL – Ácido clorídrico IARC- Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer IC50 – Concentração que inibe 50% das células ICE – Enzimas Conversoras de Interleucinas IGROV - Câncer de ovário INCA – Instituto Nacional do Câncer INK4 – Inibidores específicos de CDK4 I-OHP – Oxaliplatina JC-1 – Iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro-1,1,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina K562 - Linhagem de células de Leucemia Mieloide Crônica humana KP1019 - Indazol trans-[tetraclorobis (1H-indazol)rutenato(III) L929 – Linhagem Fibroblasto de Pulmão de Camundongo LCM – Leucemia mieloide crônica M19 - Melanona MCF-7 - Câncer de mama MOMP - Permeabilização Membrana Mitocondrial Externa mRNA – RNA mensageiro MTT – 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5 difenil-tetrazólio Na+/K+ – Sódio e Potássio NAMI-A: ImH[trans-RuCl4(DMSO)Im] NCCD - Comitê de Nomenclatura sobre Morte Celular O2 – Oxigênio ºC – grau Celsius Omi/HtrA2 – Proteína-2 exige alta temperatura OMS – Organização Mundial de Saúde TP53 – Proteína citoplasmática PBS – Tampão fosfato-salino pH – Potencial hidrogeniônico ou potencial hidrogênio iônico PI – Iodeto de Propídio pNA - Cromóforo p-nitroanilima PP2A - Proteína Fosfatase 2A Pt – Platina qPCR – PCR em tempo real RIP1 – Proteínas quinase interagindo com receptor 1 RIP3 – Proteínas quinase interagindo com receptor 3 RIPK 3 - Proteína Quinase de Interação com Receptor-3 RNA – Ácido ribonucleico RNAse – Ribonuclease ROS - espécies reativas de oxigênio rpm – rotações por minuto RPMI 1640 – Meio de cultura RT-PCR – Reação em Cadeia da Polimerase com transcrição reversa Ru – Rutênio S –Síntese Fase S – Ciclo celular S180 - Sarcoma 180 murino SDS – Sulfato Dodecil De Sódio Sigma – Sigma-Aldrich Co St Louis, Mo, Eua SKBR-3 - Carcinoma de mama humano SKI – heptaplatina SMAC - Segundo Ativador de Caspase Derivado da Mitocôndria SMases - ativação de esfingomielinases TNF – Fator de Necrose Tumoral TNFR – Receptor do fator de necrose tumoral TNFR1 – Receptor de morte celular TRAIL – Fator de Necrose Tumoral UFG – Universidade Federal de Goiás UFU – Universidade Federal de Uberlândia WIDR - Câncer de colon ΔΨm – Potêncial de membrana mitocôndrial LISTA DE FIGURAS - INTRODUÇÃO Figura 1 – Interação da ação de agentes antineoplásicos nas fases do ciclo celular .................................................................................................................................. 29 Figura 2 – Via de sinalização molecular da necroptose ........................................... 35 Figura 3 - Ativação da apoptose pelas vias extrínseca e intrínseca .................. 39 Figura 4 – Via de sinalização de receptores de morte e receptores dependentes. .. 40 Figura 5 - Via de apoptose mitocondrial dependente e independente de caspases. 42 Figura 6 - Estrutura química da cisplatina ................................................................ 43 Figura 7 – Estrutura química de antitumorais baseados em de platina .................... 44 Figura 8 – Ligação intrafita (à esquerda) e interfita (à direita) de compostos de platina e a molécula de DNA ..................................................................................... 45 Figura 9 – Estrutura química dos compostos conhecidos como NAMI-A (H2im)[trans-RuCl4(Him)(DMSO)] (A), e KP1019 - Indazolium trans-[tetrachlorobis(H1 indazole)ruthenate(III) (B).......................................................................................... 47 Figura 10 – Estrutura química de complexos de rutênio III ...................................... 48 Figura 11 - Mecanismo de ação do rutênio no ambiente da célula tumoral ............. 51 Figura 12 – Provável Mecanismo de ação de compostos de rutênio (II) no ambiente da célula tumoral ....................................................................................................... 52 LISTA DE TABELAS - INTRODUÇÃO Tabela 1 – Relação entre ciclo celular e principais classes de agentes antineoplásicos.......................................................................................................... 29 Tabela 2 - Classificação funcional das formas de morte de células regulares .......... 32 Tabela 3 – Complexos de Rutênio II e III utilizados no desenvolvimento do trabalho .................................................................................................................................. 59 Tabela 4 - Sequências de primers utilizados para o ensaio real time RT-PCR ........ 69 LISTA DE FIGURAS E TABELAS DO ARTIGO 1 Figure 1 - Chemical structure of cis-tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate .................................................................................................................................. 86 Figure 2 - Anti-proliferative activity of cis-tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line. ............................................................ 76 Figure 3 - Cytotoxic activity of cis-tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line (a and b)............................................................... 77 Figure 4 - Induction of DNA strand breaks of K562 cells cultured in the presence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound. ................................................................... 79 Figure 5 - Cell cycle profile histogram of K562 cells treated with cistetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. ........................................................ 80 Table 1. Cell cycle analysis of K562 tumor cell lines after treatment with cistetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate ............................................................... 81 LISTA DE FIGURAS E TABELAS DO ARTIGO 2 Figure 1 - ORTEP illustrates the [RuCl(bzCN)(bipy)(dppe)]PF6.0.75C4H10O complex, showing the atom labels and the 50% probability of ellipsoids. ...............................109 Figure 2 - The cell cycle status of the S180 cells after treating with [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 µM) complex for 24 and 48 h (Graphical A and B) ................................................................................................................................112 Figure 3 – Effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 on S180 cells. A and B - The harvested cells were stained and washed with phosphate-buffered saline, and apoptosis was assayed by using an annexin V-fluorescein isothiocyanate/PI assay kit in a double-labeling system for 24 and 48 h. ...........................................................114 Figure 4 - Effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 in S180 cells, o test the ΔΨm was determined using JC-1 (5,5¢,6,6¢-tetrachloro-1,1¢,3,3¢- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide). ........................................................116 Figure 5 – Effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 on the Bcl2 protein of S180 cells after 24 h of exposure in concentration of 24 and 48 µM. Data show the means±SD of two experiments ..................................................................................................117 Figure 6 - Activation of Casp3, 8 and 9 in S180 cells treated with 24 µM of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 for 24 h. ......................................................................118 Figure 7 – Effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 on the mRNA expression of Casp3, 8 and 9; Bax and Tp53 were evaluated by real-time quantitative PCR ...................120 Table 1 - The IC50 (µM) values of ruthenium II complexes against the selected cell lines. Data show means ± SD of three independent experiments ...........................111 Table 2: Crystallographic data for the [RuCl(bzCN)(bipy)(dppe)]PF6 complex .......104 Table 3: Primer sequences used for the real time RT-PCR assay..........................108 Scheme 1 - A schematic illustration of Ru II activating the intrinsic and extrinsic passage of the carcinogen cell ................................................................................121 ANEXOS Anexo 1 - Atypical fluoroquinolone gold(III) chelates as potential anticancer agents: Relevance of DNA and protein interactions for their mechanism of action. European Journal of Medicinal Chemistry 55 (2012) 67e73 ....................................................150 Anexo 2 - Induction of Cell Cycle Arrest and Apoptosis by Ruthenium Complex cis(Dichloro)tetramineruthenium(III) Chloride in Human Lung Carcinoma Cells A549. Biol Trace Elem Res; DOI 10.1007/s12011-011-9275-7 .........................................151 Anexo 3 – Cis-[RuCI(BzCN)(N-N)(P-P)]PF6 complexes: Synthesis and in vitro antitumor activity (BzCN = benzonitrile; N-N = 2,2’-bipyridine; 1,10-phenanthroline; PP = 1,4-bis(diphenylphosphino) butane, 1,2-bis(diphenylphosphino)ethane, or 1,1’(diphenylphosphino)ferrocene) ...............................................................................152 RESUMO Fármacos à base de cisplatina ainda são os anticancerígenos mais utilizados no mundo. Os compostos de rutênio têm sido objetos de grande atenção devido as suas propriedades antimetastática, baixa toxicidade e vários estados de oxidação (Ru (II), Ru (III) e Ru (IIV)) em condições fisiológicas. O presente trabalho teve como objetivo investigar in vitro os efeitos citotóxico e mecanismo de morte do complexo Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) na linhagem tumoral de leucemia mielóide crônica (K562) e do complexo de rutênio (II) coordenado a ligante fosfina e nitrila [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6, em linhagem tumoral S180 a partir das técnicas de ensaio de viabilidade celular, ensaio de cinética das fases do ciclo celular, ensaio anexina V/Iodeto de Propídeo, ensaio de potencial de membrana mitocondrial e expressão gênica por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que o complexo de rutênio (III) provoca uma significativa redução na proliferação de células K562. O complexo de rutênio (III) induziu uma IC50 =18,28 µM. A análise por citometria de fluxo indicou um efeito sub-G1 dos complexos de rutênio sobre células de K562. O composto provocou um aumento de dano significativo nas células em todas as concentrações testadas em comparação ao controle negativo, o que pode ser associado à citotoxicidade com efeito direto sobre o DNA das células de K562. A partir do ensaio de viabilidade celular pela técnica de redução do MTT, verificou-se que o complexo de rutênio (II) coordenado a fosfina e nitrila apresentou atividade citotóxica frente à linhagem tumoral S180 com IC50 17,02±8,21µM e IC50 de 53,73 ± 5,71 para linfócito. Na análise do ciclo celular de células tumorais S180 tratadas com o complexo de rutênio (II), casou indução de G0/G1, fase S e G2/M. Na análise dos ensaios de apoptose, os resultados demonstraram que o complexo de rutênio (II) induziu morte celular via apoptose na linhagem tumoral S180, como evidenciado pelo aumento no número de células anexina V positivo, despolarização do potencial de membrana mitocondrial, ativação das caspase 3 (Casp3) e 8 (Casp8) e aumento dos níveis de expressão de caspase-3 (Casp3) (mRNA), Bax (mRNA) e Tp53 . A partir dos resultados conclui-se que ambos os complexos de rutênio (II) e (III) induzem atividade citotóxica frente aos modelos de células testadas, sendo que a atividade está correlacionada às alterações nas fases do ciclo celular e indução de morte celular via apoptose. Palavras-chave: Apoptose, Ciclo Celular, Citotoxicidade, Complexos de Rutênio II e III. ABSTRACT The resistance acquired by some tumor cell lines retricts the use of drugs made of platinum because of Ruthenium compounds have been objects of great attention for presenting antimetastatic properties and low toxicity. Ruthenium compounds form compounds with the most different chemical binders, presenting good behavior and expanding the possibilities offor biological applications. A wide variety of coordination has enabled studies on ruthenium complexes, andseveral oxidation stages (Ru (II), Ru (III), and Ru (IV)) under physiological conditions and the rate of binder substitution. This study ranges the citotoxic activity of ruthenium (III) compound cisTetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate - {Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} to treat human erythroleukemia (K562) tumor cell lineand the complex of ruthenium (II) coordinated a phosphine ligand and nitrile front tumor lineage S180 through the techniques of assay cell viability, assay kinetics of cell cycle phases, annexin V assay/ propidium iodide, test of mitochondrial membrane potential, test comet and gene expression through real time PCR. Both antiproliferative and cytotoxic activity revealed that K562 cells cultured with ruthenium (III) compound showed meaningful decrease in proliferation. Ruthenium(III) compound induced the IC 50 value was of 18.28 µM set againts the cell cycle profiles cells not treated. Flow cytometric analysis indicated a sub-G1 arresting effect of ruthenium compound on K562 cells. Through the cell viability assay through MTT reduction technique, it was found that the complex of ruthenium (II) phosphine coordinated and nitrile presented cytotoxic activity when facing the tumor strain S180 with IC50 17.02±8.21µM and IC50 de 53.73 ± 5.71 µM for lymphocyte. When analyzing the cell cycle of tumor cells S180 treated with complex of ruthenium (II) caused increase in cells in G0/G1 and in S phase decreased. We observed an increase G2 / M. In the analysis of apoptosis assays, the results pointed that the complex ruthenium (II) induced cell death via apoptosis in tumor strain S180 as proved the increase in annexin cells V positive, depolarization of the mitochondrial membrane potential, activation of caspase 3 (Casp3) and 8 (Casp8) and increased expression levels of caspase-3 (Casp3) (mRNA), Bax (mRNA) and Tp53. The results lead to the conclusion that both complexes of ruthenium (II) and (III) induce cytotoxic activity against cell models tested, and that this activity correlates with alterations in cell cycle phases and induction of cell death via apoptosis. Keywords: Apoptosis, Cell Cycle, Cytotoxicity, Ruthenium Complexes II and III. 25 1. INTRODUÇÃO 1.1. Câncer O câncer é o resultado do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas que comprometem o controle do crescimento celular normal e a diferenciação terminal, sendo que o acúmulo de mutações no DNA é a causa subsequente ao desenvolvimento neoplásico e, consequentemente, ao surgimento da doença (HOLLSTEIN et al., 1991; LODISH et al., 2000; PARMIGIANI & CAMARGO, 2004). A carcinogênese pode ser compreendida como um processo complexo de múltiplas etapas, podendo envolver muitos genes, particularmente os que regulam a estabilidade e o reparo do DNA (quebras e perdas cromossômicas), o crescimento celular, instabilidade genômica e mecanismos epigenéticos, a imunidade e a quimiorresistência às drogas. Os principais grupos de genes envolvidos nesse processo são: proto-oncogenes, que estimulam o crescimento celular, impedem a diferenciação e a morte celular; genes supressores de tumor, que limitam a proliferação das células, controlando negativamente a proliferação e a sobrevivência celular. O desequilíbrio desse sistema pode alterar a função de genes envolvidos, levando à proliferação descontrolada de células e ao acúmulo de sucessivas anormalidades genéticas, características do câncer (ANDERSON et al., 1994; NAGAI, 1999; SIGAL & ROTTER, 2000; CAVALCANTE, et al., 2002; GLEICH & SALAMONE, 2002; DOUCAS & BERRY 2006; DANTAS, et al., 2009). As alterações genéticas conferem novas características fenotípicas às células neoplásicas, garantindo a malignidade tumoral, tais como: autossuficiência em sinais de crescimento, resistência aos sinais antiproliferativos, resistência à morte celular, potencial replicativo ilimitado, angiogênese sustentada, reprogramação do metabolismo energético, evasão do sistema imunológico, metástase, além de estresse metabólico, proteotóxico, mitótico, oxidativo e dano ao DNA (DIFFLEY & EVAN, 1999; HANAHAN & WEINBERG, 2011). Em 2011, a Organização Mundial de Saúde (OMS) identificou o câncer como uma das quatro principais ameaças à saúde humana (junto às doenças cardiovasculares, doenças respiratórias crônicas e diabetes) (THE WORLD HEALTH ORGANISATION 2008-2011). Nessa pesquisa foram registrados 12,7 milhões de novos casos e 7,6 milhões de mortes por câncer no mundo. 26 Em pesquisa recente, a Organização Mundial de Saude (OMS), junto à Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer (IARC), divulgou que em 2012, foram 14,1 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes por câncer em todo o planeta. As estimativas de prevalência para 2012 mostram que houve 32,6 milhões de pessoas (com idade superior a 15 anos) que tiveram um câncer diagnosticado nos últimos cinco anos (THE WORLD HEALTH ORGANISATION 2014). As estimativas da OMS é que haverão cerca de 22,2 milhões de novos casos de câncer diagnosticados anualmente em todo o mundo até 2030 (BRAY et al., 2012). No Brasil, de acordo com Instituto Nacional do Câncer (INCA) para o ano de 2014 aponta a ocorrência de aproximadamente 580 mil casos novos de câncer, o que representa um aumento de 11% em relação à previsão nacional para 2012 (INCA/MS, 2014). 1.2. Ciclo celular e fármacos quimioterápicos O mecanismo de divisão celular é um evento precisamente controlado e a progressão de uma fase para outra é controlada por uma maquinaria bioquímica conservada, que não apenas coordena esse processo, mas também está ligada a sinais extracelulares de controle de crescimento e proliferação (PINTO & FELZENSZWALB, 2003; TAJARA, 2004). De acordo com Almeida e colaboradores 2005 o ciclo celular pode ser dividido em cinco fases: G1, S, G2, M e G0. Na fase G0, as células encontram-se em repouso, ou seja, não estão replicando e a atividade nuclear é alta. Quando as células passam para a fase G1, ocorre a preparação para a divisão celular e a produção de constituintes essencias celulares que serão necessários na nova célula, além de preparar o DNA para a síntese, que irá ocorrer na fase S. Nas fases G1 e S há diversos mecanismos que regulam o processo de divisão celular. Na fase G2 haverá a síntese de componentes para a mitose e após a divisão celular, com a formação de duas células filhas e, finalizado o ciclo celular, as células tornam a entrar em G0. Entretanto, células tumorais após terminarem seu processo de replicação não retornam para G0, e assim que a fase M termina vão para a fase G1 (DE ALMEIDA et al., 2005). 27 O princípio do ciclo celular e as passagens por suas fases são controlados e regulados por proteínas como as ciclinas e quinases dependentes de ciclinas (CDK). Essas, por sua vez, checam a progressão do ciclo e mantêm as células em divisão, levando-as à apoptose, caso as condições não sejam favoráveis, no entanto, a falha de uma ciclina ou a mutação de alguma das proteínas envolvidas pode levar ao surgimento de tumores (BARBACID, 2005). As funções de CDK são contrabalanceadas pela atividade dos inibidores de proteínas CDK (CKIS - Inibidores de Quinase-Ciclina), que incluem os inibidores universais p21 (Cdkn1a); p27 (Cdkn1b); e p57 (Cdkn1c) atuantes em vários períodos do ciclo celular, por meio de sua união a CDKS complexadas com as ciclinas. As proteínas INK4 (inibidores específicos da CDK4) têm como alvo específico as quinases dependentes de ciclinas D. Quatro diferentes proteínas INK4 foram identificadas: p15 (Cdkn2b), P16 (Cdkn2a), p18 (Cdkn2c) e p19 (Cdkn2d) (PINTO & FELZENSZWALB, 2003; TAJARA, 2004; SCHWARTZ & SHAH, 2005). Um dos principais componentes envolvidos no ponto de checagem e no reparo de erros no DNA é o fator de transcrição TP53 (SENGUPTA & HARRIS, 2002; MEEK, 2009). O dano ao DNA induzido em células em proliferação resulta na ativação do ponto de checagem de reparo, a partir do qual ocorrem a parada do ciclo celular e o recrutamento da maquinaria de reparo, evitando assim que a informação genética incorreta seja transmitida para as células-filhas. Quando ocorrem danos à molécula de DNA, que são irreparáveis, essa proteína ativa a transcrição de vários genes envolvidos no controle celular (p21(Cdkn1a), Gadd45), bem como genes envolvidos na indução de apoptose BAX (Proteína X associada ao BCL2) (NIIDA & NAKANISHI, 2006; HOUTGRAAF & COLS, 2006). Os checkpoints representam o controle do ciclo celular, um mecanismo de “prevenção”, cuja função é a de evitar o acúmulo de erros genéticos durante as divisões celulares, protegendo a integridade genômica das células. Os checkpoints realizam pelo menos quatro tarefas: induzem rapidamente um retardo no ciclo celular; ajudam a ativar o reparo do DNA; mantêm o ciclo celular bloqueado até que o reparo seja completado e reiniciam a progressão do ciclo. Dessa forma, as instabilidades genômicas podem resultar de defeitos nesses mecanismos de controle e assim levar à transformação de células normais em células tumorais (BARTEK & ELUKAS, 2007; MOTOYAMA & NAKA, 2004). 28 A perda do controle do ciclo celular é uma das principais características dos tumores. Alterações nos componentes do ciclo celular e nas vias de sinalização dos mecanismos de checkpoint ocorrem na maioria dos tumores humanos, sendo que essas alterações genéticas são resultantes da desregulação de oncogenes e genes supressores tumorais, os quais têm importantes implicações na otimização dos atuais regimes terapêuticos e na seleção de novos alvos do ciclo celular (STEWART et al., 2003). Fármacos da quimioterapia antineoplásica atualmente utilizados exigem a compreensão da cinética do ciclo celular para o seu uso apropriado. Muitos dos mais potentes agentes citotóxicos atuam em fases específicas do ciclo celular e, portanto, têm atividade apenas em células tumorais que estão em processo de divisão (FRESHSNEY, 2007). Nos estudos in vitro da ação citotóxica dos fármacos antineoplásicas, verificam-se que há distúrbios do ciclo celular e, posteriormente, morte celular, embora cada fármaco apresente mecanismos de ação específicos. Isto sugere que vários estímulos citotóxicos iniciam os eventos que conduzem à morte celular (FRESHSNEY, 2000; ALMEIDA et al., 2005). Considerando uma maior atividade em determinadas fases do ciclo celular, os fármacos antineoplásicos são classificados em três categorias: 1) ciclo celular específico/fase específica, 2) ciclo celular específico/fase não específica e 3) ciclo não específico, que diz respeito a fármacos que não agem necessariamente em fases de crescimento, mas em células em repouso (fase G0) (Tabela 1) (ALMEIDA et al., 2005). A figura 1 demonstra a atuação dos fármacos antitumorais sobre o ciclo celular. Muitos dos agentes antineoplásicos convencionais são genotóxicos e desencadeiam respostas de ativação de checkpoints em ambos os tecidos normal e tumoral. As células que são deficientes no controle dos checkpoints, geralmente, são mais sensíveis aos danos genotóxicos ou microtubular que células com checkpoints ativos. No entanto, células tumorais com checkpoint funcionais são susceptíveis a reduzirem a eficácia desses medicamentos a partir do bloqueio da progressão do ciclo celular e facilitar o reparo do dano induzido por fármacos antineoplásicos (MEDEMA & MACUREK, 2012; GABRIELLI et al., 2012) 29 Tabela 1 – Relação entre ciclo celular e principais classes de agentes antineoplásicos (modificado de ALMEIDA et al., 2005). 1. Agentes ciclo-celular específicos (CCS, “Cell Cycle-Specific”) 1.1. Agentes Antimetabólitos 1.1.a. Análogo do ácido fólico 1.1.b. Antagonistas das pirimidinas 1.1.c. Análogos das purinas e inibidores correlatos 1.2. Agentes Hormonais 1.2.a. Adrenocorticosteróides 1.2.b. Progestinas 1.2.c. Estrogênios 1.2.d. Androgênios 1.2.e. Antiestrogênio 1.2.f. Antiandrogênio 1.2.g. Análogo do hormônio liberador de gonadotropina 1.2.h. Inibidor da aromatase 1.2.i. Inibidor do hormônio peptídico 1.3. Produtos Naturais 1.3.a. Alcalóides vegetais 1.3.a.1. Alcalóides da vinca 1.3.a.2. Podofilotoxinas (Epipodofilotoxinas) 1.3.a.3. Paclitaxel (Taxol) 1.3.b. Enzimas 2. Agentes ciclo-celular não específicos (CCNS, “Cell Cycle-NonSpecific”) 2.1. Produtos Naturais 2.1.a. Antibióticos naturais 2.1.a.1. Antraciclinas 2.1.a.2. Mitomicina 2.1.a.3. Dactinomicina 2.1.a.4. Plicamicina 2.1.a.5. Bleomicina 2.1.b. Alcalóides pirrolizidínicos 2.2. Complexos de Coordenação de Platina 2.2.a. Cisplatina (cis-DDP) 2.2.b. Carboplatina (CBDCA) 2.2.c Agentes Alquilantes Diversos 2.3.a. Mostardas nitrogenadas 2.3.b. Nitrossuréias 2.3.c. Triazenos 2.3.d. Alquil sulfonatos 3) Agentes ciclo não específico 3.1. Taxóides Figura 1 - Interação da ação de agentes antineoplásicos nas fases do ciclo celular. Fonte: de ALMEIDA et al, 2005 A radiação ionizante causa quebras de fita dupla no DNA, induzindo a ativação dos checkpoints nas fases G1 e G2 do ciclo celular. Os antimetabólitos, 30 como o hidroxiuréia, bloqueiam a replicação, parando as células na fase S do ciclo celular. Já os agentes alquilantes ou inibidores de Topoisomerase II ativam o checkpoint G2, enquanto drogas antimitóticas acionam o checkpoint mitótico (GABRIELLI et al., 2012). Os agentes antineoplásicos não são ativos somente no processo de divisão celular, os mais antigos e mais usados são conhecidos como agentes alquilantes, que interagem quimicamente com o DNA. Fato é que na quimioterapia (método que utiliza compostos químicos, chamados quimioterápicos, no tratamento de doenças causadas por agentes biológicos) são descritos muitos alvos a serem estudados no intuito de que se estabeleçam novos fármacos antitumorais (ALMEIDA et al., 2005). Os fármacos empregados no tratamento do câncer comprometem tanto as células normais como as neoplásicas, porém, ocasionam maior dano às células malignas que as dos tecidos normais, devido às diferenças quantitativas entre os processos metabólicos dessas duas populações celulares. Grandes avanços têm sido alcançados no desenvolvimento, seleção e aplicação de fármacos quimioterapêuticos, muitas vezes com sucessos clínicos notáveis, como no caso de tratamento para os linfomas ou de fármacos baseados em platina para o tratamento de câncer testicular. A quimioterapia antineoplásica tem como objetivo o tratamento de diversos tumores malignos, tornando-se uma das mais importantes e promissoras maneiras de combate ao câncer. Essa forma de tratamento pode ser empregada de maneira curativa ou paliativa, dependendo do tipo e extensão do tumor e da condição física do paciente (MEALEY et al., 1994). Os quimioterápicos antineoplásicos podem ser classificados em: (1) agentes alquilantes, que atuam por meio da formação de ligações covalentes com o DNA, impedindo sua replicação; (2) antimetabólicos, que bloqueiam ou subvertem uma ou mais vias metabólicas envolvidas na síntese do DNA; (3) medicamentos obtidos por produção natural ou alcalóides; (4) hormônios, dos quais os mais importantes são os esteróides, isto é, glicocorticóides, estrogênios e androgênios e fármacos que suprimem a secreção de hormônios ainda ou antagonizam sua ação; (5) imunoterápicos, embora incipiente; (6) antibióticos, grupos de substâncias com estrutura química diversa, que interagem com o DNA e inibem a síntese de proteínas; (7) inibidores mitóticos, que levam à paralisação da divisão celular em metáfase ao atuarem sobre a tubulina, proteína formadora do fuso; (8) drogas alvo-dirigidos, o objetivo do tratamento com essas drogas é dirigi-las a uma 31 molécula anormal da célula de câncer, impedindo seu funcionamento (anticorpos e inibidores de quinases); (9) outros agentes com mecanismos de ação que não permitem a inclusão nos grupos apresentados anteriormente, como a dacarbazina, indicada no tratamento do melanoma avançado, sarcomas de partes moles e linfomas (GOODMAN & GILMAN, 2002). 1.3. Tipos de Morte celular Desde as primeiras descrições do mecanismo de morte celular programada, que datam de meados dos anos 1960, (LOCKSHIN & WILLIAMS 1964; KERR 1965; LOCKSHIN & WILLIAMS, 1965; ELMORE, 2007), o termo apoptose foi usado pela primeira vez em um clássico artigo de Kerr, Wyllie e Currie em 1972 para descrever uma morte celular morfologicamente distinta, embora o conceito de apoptose tenha sido explicitamente descrito muitos anos antes (KERR et al, 1972;. PAWELETZ, 2001; KERR, 2002; ELMORE, 2007). No entanto, é importante notar que outras formas de morte celular programada têm sido descritas e outras formas ainda podem ser descobertas (FORMIGLI et al., 2000; SPERANDIO et al., 2000; DEBNATH et al., 2005; GALLUZZI et al., 2012). Várias tentativas têm buscado classificar a morte celular com base nas características morfológicas, mas estudam mostram que somente este critério não é suficente na classificação de formas de morte celular (SCHWEICHEL & MERKER, 1973). De acordo com o Comitê de Nomenclatura sobre Morte Celular (NCCD), a morte celular pode ser classificada de acordo com critérios morfológicos, enzimáticos (sem envolvimento de nucleases ou com o envolvimento de distintas classes de proteases como caspases, catepsinas e transglutaminase) e aspectos funcionais (morte programada ou acidental, fisiológico ou patológico) (KROEMER et al., 2009; GALLUZZI et al., 2012). Considerando os vários critérios de classificação citados acima, os tipos de morte celular, segundo Galluzzi et al., (2012), são: apoptose, necrose regulada, autofagia e catástrofe mitótica. Além dessas, outras modalidades de morte celular, tais como anóiques, entose, piroptose, têm sido citadas como novas modalidades (Tabela 2). 32 Tabela 2 - Classificação funcional das formas de morte de células regulares (modificado de GALLUZZI et al., 2012). Principais características bioquímicas Anoiques Regulação baixa de EGFR. Inibição de ERK1 sinalizando falta de ß1-integrina engajada. Superexpressão de BIM. Caspase-3 (-6,-7) ativação. Lipidação de MAP1LC3 -Degradação de SQSTM1 Dependência de Caspase Exemplos de intervenções inibitórias BLC-2 superexpressão, administração de Z-VADfmk ++ Morte de célula autofágica Inibidores VPS34. Inibição genética de AMBRA1, ATG5 , ATG7, ATG12 ou inibição genética de BCN1 Superexpressão de BLC2. Administração de Z-VADfmk Superexpressão de BLC2 Apoptose intriseca dependente de caspase MOMP. Dissipassão irreversível de ΔΨm Independencia de caspase intríseca apoptose Entose Liberaçáo de proteínas IMS. Inibição de corrente respiratória Ativação de RHO. Ativação de ROCK1 -- Inibição genética de metalotioneína 2A. Inibição de lisossomal Expressão de CrmA. Inibição genética de Caspases (8 e 3) Apoptose extrínseca por morte de receptores Dependencia de sinalização de receptor. Ativação de Caspase-8 (-10). Abertura de BID e MOMP (em células de tipo II). Ativação de Caspase-3 (-6 -7) Dependência de sinalização de receptor. Ativação de PP2A. Ativação de DAPK1. Ativação de Caspase-9. Ativação de Caspase-3 (-6, 7). Ativação de caspase-2 (em algumas instancias) Ativação de TP53 ou TP73 (em algumas instancias); araste mitótico ++ Apoptose extrínseca por dependência de receptores ++ Inibição genética de Caspases (9 e 3). Inibição genética de PP2A. Administração de Z-VAD-fmk. Catástrofe Mitótica -- Inibição genética de TP53 (em algumas instancias) Farmacológica ou inibição genética de caspase-2 (em algumas instancias) Administração de necrostatin(s). Inibição genética de RIP1/RIP3 Necroptose Sinalização de receptor de morte. Inibição de Caspase. RIP1 e/ou RIP3 ativação -- 33 Netose Inibição de Caspase. Ativação de oxidase NADPH Inibição de autofagia. Inibição de oxidase NADPH. Inibição genética de PAD4 Administração de ZYVAD-fmk. Inibição genética de Caspase-1 -- Piroptose Ativação de Caspase-1. Ativação de Caspase-7. Secreção de IL-1ß e IL-18 ++ Abreviações: ATG, autofagia; BCN1, beclin 1: ΔΨm potencial transmembranar mitocondrial; CrmA, modificador de resposta citocian A; DAPK1, proteina quinase associada a morte 1; EGFR, receptor de fator de crescimento da epiderme; ERK1, regulador extracelular de quinase 1; IL, interleucina; MAP1LC3, proteina leve 1 do microtubulo associada a cadeia 3; MOMP, permebialização da membrana externa mitocondria; NET, armadilha extracelular de neutrófilos; PAD 4, peptidilarginine deiminase 4; PAR, poli(ADP-ribose); PARP1, poli(ADP-ribose) polimerase 1; PP2A, proteina fosfatase 2A; ROCK1, RHO-associada, proteína quinase enrolada em espiral 1; SQSTM1, sequestosome 1; TG, transglutaminase; Z-VAD-fmk, N-benziloxicarbonil-Val-Ala-Aspfluorometilquetone; Z-YVAD-fmk, N-benziloxicarbonil-Tyr-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilquetone. Para fins de classificação, as intervenções farmacológicas e genéticas devem ser consideradas inibitórias quando realmente reduzir a incidência de morte celular, mas não quando provocar apenas uma mudança entre modalidades diferentes de células de morte ou quando alterar a morfologia da morte celular. A necrose foi considerada por muito tempo como um mecanismo de morte celular acidental. É um processo que envolve a perda da integridade da membrana celular, com inchaço citoplasmático, formação de vacuolos, retículo endoplasmático inchado, distenção ou rompimento mitocôndrial, lise dos lisossomos e liberação do conteúdo citoplasmatico para o tecido circundante (MAJNO & JORIS 1995; TRUMP et al., 1997; CHAMOND et al., 1999) levando a inflamação (KUROSAKA et al., 2003) (Tabela 2). A partir do trabalho de vários laboratórios de pesquisa, atualmente está claro que a necrose pode ocorrer de forma regulada, a partir de um mecanismo chamado “necroptose”, cujo papel é importante em processos fisiológicos e patológicos (FULDA, 2013). O termo “necroptose” tem sido recentemente utilizado como um sinônimo de necrose programada que depende da atividade da Proteína Quinase e da Interação com Receptor-1 (RIPK1) (KROEMER et al., 2009). Marcadores clássicos de apoptose, como condensação de cromatina e fragmentação nucleossomal de DNA não são vistos em morte via necrose (BROWN e ATTARDI, 2005). Entretanto, semelhantes à apotose, células necróticas externalizam a fosfatidilserna antes da permeabilização da membrana plasmática, promovendo, assim, o seu reconhecimento pelos fagócitos (GALLUZZI et al., 2011). Atualmente os mecanismos moleculares responsáveis pela necroptose estão em processo de identificação. A ativação da necroptose pode acontecer pelos mesmos ligantes que ativam a apoptose, como Fator de Necrose Tumoral (TNF). Nessa via, o ligante TNFα se liga ao receptor TNFR1; desse modo, essa interação 34 aciona o recrutamento das proteínas de Domínio de Morte Associado à TNFR (TRADD), RIP-1, (Proteínas inibidoras de Apotose) IAPs, Fator Associado a TNFR2 (TRAF-2) e Fator Associado a TNFR5 (TRAF-5), que constituem uma estrutura chamada de complexo I. As proteínas IAPs realizam a poliubiquitinação de RIP-1, acionando a ativação de NF-kB. No entanto, quando RIP-1 sofre desubiquitinação, a composição do complexo se modifica passando a se chamar complexo II (GALLUZZI et al., 2011). O complexo II, também chamado de Complexo de Sinalização de Indução de Morte (DISC), é constituído por RIP-1, Proteína Quinase de Interação com Receptor3 (RIPK-3), TRADD, Domínio de morte associada ao CD95(FADD) e CASP8 (caspase-8). Na presença de CASP8 (caspase-8) ativa, RIP-1 e RIP-3 são desativadas, acarretando em apoptose. No entanto, quando CASP8 (caspase-8) não pode ser ativada devido a condições genéticas ou farmacológicas, RIP1 e RIP3 são fosforiladas, formando assim um complexo molecular chamado de necrossoma (Figura 2). O necrosoma, por sua vez, estimula para múltiplos sinais pró-necróticos, tais como: permeabilização da membrana lisossomal e liberação citosólica de hidrolases lisossomais, ativação de esfingomielinases (SMases) e alterações metabólicas nas mitocôndrias, resultando na geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), que danificarão diretamente macromoléculas, incluindo o DNA, proteínas, lípideos, e promoverão o decréscimo abrupto dos níveis de ATP (GALLUZZI et al., 2011; NIKOLETOPOULOU et al., 2013). A autofagia é um processo catabólico altamente regulado que envolve a degradação de componentes próprios de uma célula a partir da maquinaria lisossomal. A autofagia desempenha um importante papel no crescimento celular, desenvolvimento e homeostase, ajudando a manter um equilibrio entre síntese, degradação e subsequente reciclagem dos produtos celulares (GALLUZZI et al., 2011). Com base em características morfológicas, o termo “morte celular autofágica” tem sido amplamente empregado para indicar tipos de morte celular que são caracterizados por uma enorme vacuolização citoplasmática, frequentemente (embora nem sempre) indicando aumento do fluxo autofágico. Embora tal expressão originalmente não indique qualquer consideração funcional, os cientistas têm adotado o termo "morte celular autofágica" para indicar que autofagia seria realmente o falecimento celular (Tabela 2) (GALLUZZI et al., 2012). 35 Figura 2: Via de sinalização molecular da necroptose. Fonte: TSUDA et al., 2012 O termo “morte celular autofágica” aplica-se a dois mecanismos distintos. Em primeiro lugar, processos fisiológicos de morte celular in vivo são mediados por autofagaia, durante o desenvolvimento da D. melanogaster. Em segundo lugar, autofagia parece ser responsável pela morte de algumas células cancerosas (especialmente quando moduladores essenciais de apoptose como BAX e BAK ou caspases ausentes). No entanto, na maioria dos casos conhecidos, autofagia constitui uma resposta citoprotetora ativada pelas células que morrem na tentativa de lidar com stress, o que não impede a morte celular. Ao contrário do processo de apoptose, as células que morrem por autofagia têm pouca ou nenhuma associação com o processo de fagocitose (KELEKAR, 2005; KROEMER et al., 2009). "Catástrofe mitótica" é o tipo de morte celular que ocorre durante a mitose; refere-se ainda a casos de morte celular que são desencadeadas por mitose anormal e executada durante a mitose ou na interfase subsequente. É resultante de uma segregação cromossômica anormal ou de danos induzidos à molécula de DNA, acompanhados de defeitos nos checkpoints. Estes danos normalmente levam a alterações morfológicas, como formação de células com múltiplos micronúcleos (multinucleação) (Tabela 2) (CASTEDO et al., 2004; KROEMER et al., 2009, GALLUZZI et al., 2012). 36 A catástrofe mitótica pode ser induzida por danos de agentes hiperpolimerizadores (taxanos, epotilones), agentes despolimerizadores (como alcaloides da vinca e colchicina) e agentes que danificam o DNA. Células tumorais são, na maioria das vezes, deficientes nos checkpoint do ciclo celular, o que as torna mais susceptíveis à mitose catastrófica após tratamento com fármacos antineoplásicos (CASTEDO et al., 2004; GALLUZZI et al., 2012) (Tabela 2). Anóiques, termo introduzido por Frisch e Francis em 1994, é uma modalidade de morte celular descrita para a resposta apoptótica de células aderentes devido à ausencia da matriz celular. Deve notar-se que a maioria, se não todos, dos casos de morte celular anóiques é executada pela maquinaria molecular de via intrínseca de apoptose (Tabela 2) (GALLUZZI et al., 2012). Entose, termo introduzido em 2007 por Overholtzer e colaboradores, é um mecanismo de morte celular no qual há "célula-em-células”. O termo entose só pode ser usado para designar morte celular quando todas as seguintes caracteristicas são observadas: em primeiro lugar, as células englobadas nunca devem sair do fagossomo e devem ser degradadas no lisossoma; em segundo lugar, o fenótipo de "célula-em-célula” deve surgir a partir de interações homotípicas e não deve envolver fagócitos; em terceiro lugar, o processo não deve ser sensível às intervenções químicas e genéticas que normalmente bloqueiam apoptose intrínseca dependente e independente de caspase (GALLUZZI et al., 2012) (Tabela 2). Piroptose termo introduzido em 2000 por Brennan e Cookson para descrever a morte peculiar de macrófagos funcionalmente infectados com Salmonella typhimurium (GALLUZZI et al., 2012) (Tabela 2). 1.4. Apoptose A apoptose é uma forma característica de morte celular programada, com importante papel durante o desenvolvimento e a homeostase celular, bem como em uma variedade de doenças, como o câncer (WYLLIE et al., 1980; RAMENGHI et al., 2000; MAURILLO et al., 2001). Ao sofrer apoptose, a célula apresenta alterações morfológicas e bioquímicas típicas. A célula apoptótica é caracterizada pelo encolhimento celular e condensação, fragmentando-se e formando os corpos apoptóticos. O vazamento do Citocromo c da mitocôndria para o citosol é uma das primeiras características 37 bioquímicas, assim como a externalização da fosfatidilserina na membrana celular, ativação de proteasese, fragmentação do DNA internucleossomal em fragmentos de 180 a 200 pares de bases. A externalização de fosfatidilserina precede a maioria das alterações morfológicas e bioquímicas citadas (MARTIN et al., 1995; HENGARTNER, 2000; COOPER, 2007). No entanto, essas alterações bioquímicas não devem ser utilizadas para definir morte celular via apoptose, uma vez que esse tipo de morte celular pode ocorrer sem a fragmentação de DNA, assim como sem a ativação de caspases (GALLUZZI et al., 2007; LIU et al., 2009). As vias de sinalização que desencadeiam o processo apoptótico são complexas, sendo subdivididas principalmente em duas: apoptose extrínsica, apoptose intrínsica (dependente de caspase e independente de caspase) (Tabela 2). O termo "apoptose extrínseca" tem sido amplamente utilizado para indicar os casos de morte celular por apoptose, que são induzidos por sinais de estresse extracelulares sendo sentidos e propagados por receptores transmembranares específicos (TNF) (Figura 3). A apoptose intrínsica pode ser desencadeada por uma infinidade de estresse intracelular, incluindo danos no DNA, estresse oxidativo, acúmulo de proteínas desordenadas no retículo endoplasmático (RE) e muitos outros. Embora a cascata de sinalização que desencadeia a apoptose intrínseca seja altamente heterogênea, tanto quanto os estímulos iniciadores, todos os mecanismos são ligados a uma mitocôndria (Figura 3) (GALLUZZI et al., 2012). A via do processo apoptótico extrínseca é mediada por receptores de morte (TNF, TNFR1, TRAMP, TRAIL e de Fas) presentes na membrana plasmática, e a via intrínseca é mediada pela mitocôndria (HAJRA & LIU, 2004; HAIL et al., 2006). Tanto a via extrínseca quanto a intrínseca possuem um grupo independente de caspases iniciadoras (casp2, 8, 9 e 10), que convergem sinais para o mesmo grupo de caspases efetoras (casp3, 6 e 7) com finalidade de executar eventos intracelulares que resultarão na morte celular programada (HAJRA & LIU, 2004; ZHANG et al., 2004). A via apoptótica extrínseca é desencadeada pela interação entre sinais de morte celular, como FASL/CD95 (receptor de superfície envolvido na ativação da apoptose), TNFR (receptor do fator de necrose tumoral) ou receptores TRAIL (Fator de Necrose Tumoral). O estímulo do ligante de morte resulta na oligomerização dos receptores e recrutamento da proteína adaptadora Domínio de Morte FAS-associada (FADD) e recrutamente de caspase iniciadora; casp8, formando o complexo de 38 sinalização de indução de morte (DISC). A auto-ativação da casp8 no DISC é seguida pela ativação de caspases efetoras, incluindo as casp3, 6, e 7, que atuam como efetoras à jusante do programa de morte celular (ASHKENAZI & DIXIT, 1998; HAJRA & LIU, 2004; HAIL et al., 2006; GALLUZZI et al., 2012). Ainda, há ativação de outros receptores de morte na membrana plasmática, especialmente do receptor de estresse celular, bem como ação das caspases iniciadoras casp8 e 10, que integram sinais de apoptose de via extrínseca àqueles de via intrínseca. Assim, é preciso avaliar sinais na membrana plasmática capazes de agir sinergicamente com sinais mitocondriais na indução de apoptose (HAJRA & LIU, 2004; HAIL et al., 2006). Em células conhecidas como células de tipo 1, a ativação de casp8 é suficiente para ativar diretamente as caspases efetoras casp3 e 7, para completar a excecução da apoptose de uma maneira independente da via mitocôndrial. Já em células como hepatócitos e células pancreáticas β (células de tipo II), casp8 medeia a clivagem proteolítica de BID (Domínio de Morte de Interação com BH3), que leva à geração da permeabilização da membrana mitocondrial e, consequentemente, à ativação da via intrínseca ou mitocondrial (Figura 4) (LI & YUAN, 2008; GALLUZZI et al., 2012). A ativação da via extrínseca pode ser desencadeada também por meio da via de receptores dependentes. Um exemplo diz respeito aos receptores UNC5A-D e Deleção Carcinoma Coloretal (DCC), os quais exercem funções de apoptose somente quando os níveis de seus ligantes (Netrina-1) estão em baixas quantidades na célula. A indução de apoptose a partir do receptor DCC é ativada quando, na ausência de seus ligantes, DCC interage com as proteínas TUCAN e DRAL para a montagem do complexo, o qual irá ativar a pró casp9. O receptor UNC5-B, na ausência do seu ligante Netrina-1, induz a apoptose a partir do recrutamento da proteína fosfatase 2A (PP2A), a qual irá realizar a desfosforilação/ativação da proteína DAPK (Proteína Quinase serina/treonina Associada à Morte). A proteína DAPK induzirá a permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP) e a ativação das casp9 e casp8 (via Bid) (Figura 4). Efetores a jusante da proteína DAPK permanecem desconhecidos, mas DAPK é conhecida por induzir a morte celular por mecanismos dependentes e independentes de Tp53 (GALLUZZIet al., 2012; DELCROS e MEHLEN, 2013). 39 Figura 3 - Ativação da apoptose pelas vias extrínseca e intrínseca. Fonte: adaptado de NIKOLETOPOULOU, 2013 A via intrínseca é desencadeada pela ação de diferentes sinais de estresse intracelular, tais como irradiação, agentes quimioterápicos, vírus, bactérias, ausência de fatores de crescimento celular e hipóxia, os quais convergem para a mitocôndria. Esta organela contém, no seu espaço intermembranar, fatores apoptogênicos, como citocromo c, AIF (Apoptosis-Inducing Factor) pró casp2, 3 e 9, SMAC/DIABLO (Second Mitochodria-DerivedA activator of Caspases/direct IAP binding protein with low pI), Omi/HtrA2 (High temperature requirement protein-2) e endonuclease G53. Além dessas proteases e as calpainas, catepsina B, gramenzima A e B, na presença de sinais apoptóticos, podem ser liberadas no citoplasma, sendo que algumas delas participam da ativação das caspases. Entretanto, dados recentes sugerem que estas podem acionar mudanças morfológicas características de apoptose de maneira independendente de caspases. Essa via apoptótica, centrada na mitocôndria, é conhecida como via intrínseca mitocondrial ou via de ativação das caspases dependente ou idependete da mitocôndria (SHARMA et al., 2000; MORAES et al., 2007; JAATTELA E MATHIASEN, 2002; GALLUZZI et al., 2012). 40 Figura 4: Via de sinalização de receptores de morte e receptores dependentes Fonte: GALLUZZI et al., 2012 A regulação da via mitocondrial é realizada pelos membros da família BCL2, proteínas citoplasmáticas capazes de integrar sinais de sobrevida ou morte celular gerados nos meio intra e extracelular (KOLLENKO et al., 2000). Essa família subdivide-se em duas classes: proteínas pró-apoptóticas (BAX, BCLXL, BCLW, McCL1, A1), as quais sensibilizam ou conduzem a célula à apoptose e anitiapoptóticas (BCL2 e BCLX) (KOLLENKO et al., 2000). A via mitocondrial também é susceptível à regulação negativa pelas proteínas da família dos IAPs (CIAP1 e CIAP2, XIAP e Survivina), as quais podem inibir, por exemplo, as CASP3 e 9, cuja atividade pode ser bloqueada pelo SMAC (segundo ativador mitocondrial de caspases) (Figura 5) (KOLLENKO et al., 2000; SHI, 2002). Além da liberação de moléculas apoptogênicas, a alteração do potencial de membrana mitocondrial interna e a transição da permeabilidade mitocondrial levam ao colapso dessa membrana, interrompendo a síntese de ATP e aumentando, consequentemente, a produção de espécies reativas de oxigênio (GALLUZZI et al., 41 2012). Na via dependente de caspases, a liberação do citocromo c, a partir da mitocôndria, leva à ativação de casp 3 a partir da ligação do citocromo c à proteína adaptadora APAF1 (Protease Apoptótica Ativadora de Fator 1) e à pró casp9, levando à formação do apoptossomo e à ativação da CASP9, a qual ativará outras caspases, como as pró casp3 e 7, culminando na apoptose via mitocondrial. As proteínas Smac/Diablo e Omi/HtrA2 facilitam a ativação das caspases a partir do sequestro ou degradação de proteínas da família IAPS (STEPHEN & GREEN, 2010; GALLUZZI et al., 2012). Mecanismos envolvendo a participação de proteases, como Calpainas, Catepsina B, Granenzima A e B, Omi/htra2, Endonuclease G e AIF, têm demonstrado induzir morte celular programada por mecanismos independentes de caspases. Essas proteases, na maioria das vezes, cooperam na via apoptótica dependente de caspases. Entretanto, dados recentes sugerem que elas também podem acionar mudanças morfológicas características de apoptose de maneira independente de caspases. No mecanismo de apoptose independente de caspases, as proteínas AIF e Endonuclease G relocam para o núcleo, no qual atuarão a partir da clivagem da molécula de DNA. Já a proteína Omi/htra2 atua por meio de sua atividade serina protease e realiza a clivagem de vários substratos, dentre esses as proteínas do citoesqueleto (JAATTELA & MATHIASEN, 2002; GALLUZZI et al., 2012). A figura 5 demonstra a via mitocondrial dependente e independente de caspase. Pesquisas realizadas sobre o processo de apoptose demonstram que este é um processo importante na quimioterapia do câncer, uma vez que a maioria dos fármacos anticancerígenos exerce seu efeito antitumoral a partir da indução de apoptose. Trabalhos na literatura têm demonstrado que fármacos convencionais, tais como flavopiridol, cisplatina, paclitaxel, doxorrubicina, induzem apoptose em células tumorais in vitro (ACHENBACH et al., 2000; MIZUTANI et al., 2005; BRENES et al., 2007). Em muitos casos, a terapia anticancerígena eventualmente resulta na ativação de caspases, sendo que tal ativação em resposta à quimioterapia pode ser iniciada a partir da ativação da via extrínseca ou através da mitocôndria pela estimulação da via intrínseca (FULDA e DEBATIN, 2006). 42 Figura 5: Via de apoptose mitocondrial dependente e independente de caspases Fonte: GALLUZZI et al., 2012 Apesar dos avanços alcançados, alguns tipos de tumores, como os sarcomas e leucemias, monstram limitações em relação aos tratamentos quimioterápicos atuais, assim como grande resistência aos estímulos apoptóticos induzidos pelos agentes antitumorais (KIM et al., 2002; GHOBRIAL et al., 2005; VILLEDIEU et al., 2007; BRENES et al., 2007). 1.5. Compostos baseados em metal usados na terapia antitumoral Metais preciosos já eram usados para propostas medicinais a.C. (há mais de 3500 anos atrás). O ouro foi utilizado em várias áreas da medicina na Arábia e China. Naquela época, metais nobres eram confiáveis no benefício à saúde, pela sua raridade, contudo, pesquisas recentes têm associado as propriedades medicinais de fármacos inorgânicos as suas propriedades biológicas específicas (ALLARDICE & DYSON, 2001). 43 Em meados da década de 1960, Rosenberg e colaboradores, descobriram, por acaso, as propriedades anticancerígenas da cisplatina {cis-[PtCl2(NH3)2]} (Figura 6), durante as investigações do efeito de campos elétricos sobre o crescimento de Escherichia coli. Os pesquisadores estavam usando eletrodos de platina em uma solução contendo cloreto de sódio e sais de amônio, entre outros constituintes, quando observaram um evento inesperado, as bactérias tornaram-se longos filamentos e passaram a não se replicar. A divisão celular de E. coli havia sido inibida. Uma análise mais extensa desta observação levou à conclusão de que o ciclo replicativo bacteriano foi inibido por complexos amino-platina formados por eletrólise (PIZARRO et al., 2009). Figura 6 - Estrutura química da cisplatina. Fonte: PIZARRO et al., 2009 A pesquisa e o desenvolvimento de fármacos à base de metais foram impulsionados a partir dessa descoberta e, desde então, complexos inorgânicos têm sido alvo de inúmeras pesquisas terapêuticas, com numerosas aplicações em diversos ramos da medicina, inclusive o câncer (DYSON & SAVA, 2006; SUSSFINK, 2010; SABALE et al., 2012). Mais de 40 anos após a sua aprovação como um agente quimioterápico pela Food and Drug Administration norte-americana (FDA), fármacos à base de cisplatina ainda são os antineoplásicos mais utilizados do mundo. A quimioterapia à base de cisplatina é responsável pela cura de mais de 90% dos casos de câncer testicular e desempenha um papel importante em alguns tratamentos contra o câncer de cabeça e pescoço, de plumão, de ovário, câncer cervical, câncer de bexiga, melanoma e linfomas (PIZARRO et al., 2009). Vários análogos de cisplatina, como a cis-diamina (ciclobutano-1,1- dicarboxilato)-platina(II), ou carboplatina, a oxaliplatina(l-OHP) são utilizados na terapia antineoplásica mundial; a nedaplatina, a heptaplatina (SKI), a lactato 1,2di(aminometil)ciclobutanoplatina(II), ou lobaplatina são utilizados somente no Japão, 44 China e Coreia (Figura 7), além de serem aplicados nos estudos de tumores que exibem resistência à cisplatina. Estes compostos são chamados de “geração secundária” dos compostos de platina (CALAMAI et al., 1998; HARTINGER et al., 2006; PIZARRO et al., 2009). Figura 7 – Estrutura química de antitumorais baseados em compostos de platina Fonte: LOOKICH & ANDERSON, 1998 O mecanismo de ação da cisplatina não está completamente elucidado. Estudos para descrever o mecanismo de ação foram realizados e eles observaram que antes de chegar ao interior celular, a cisplatina passa por reações de substituições, nas quais a principal seria a reação de hidrólise substituindo os ligantes cloretos (FONTES et al., 2005). Atualmente, é reconhecido que o alvo de ação de compostos à base de platina é a molécula de DNA, causando danos irreversíveis; evitando que a célula seja capaz de se replicar, o que leva, portanto, à morte celular (REEDIJK et al., 1987; PAGE 2012). A ligação da platina ocorre preferencialmente nos átomos de nitrogênio das bases púricas do DNA, sendo que a interação mais estável é com o nitrogênio da guanina. Há vários tipos de ligação que podem ser formadas entre o DNA e a platina, visto que as principais são: monofuncionais; bifuncionais, que podem ser de três tipos – intrafita, interfita (Figura 8) e intermolecular. Devido ao fato da platina se ligar à molécula de DNA, observa-se que o processo de divisão celular é inibido, dessa forma qualquer composto que interfira nesse processo é considerado 45 citotóxico, podendo levar à morte celular. Compostos que apresentam esse mecanismo de ação são utilizados para o tratamento de neoplasias (FONTES et al., 2005). Figura 8 – Ligação intrafita (à esquerda) e interfita (à direita) de compostos de platina e a molécula de DNA Fonte: FONTES et al., 2005 Mesmo os fármacos baseados em de platina sendo utilizados mundialmente no tratamento de neoplasias, sérias limitações são enfrentadas durante a administração desses fármacos, como sintomas gastrointestinais (náuseas, vômitos, diarreia), nefro e neurotoxicidade. Outro problema enfrentado é a resistência, pois, após 4 a 6 ciclos de tratamento, os tumores, inicialmente sensíveis ao medicamento, tornam-se resistentes (KARTALOU e ESSIGMANN, 2001; JIRSOVA et al., 2006). Essas limitações têm estimulado a busca de novos complexos metálicos de transição que apresentem reduzida toxicidade e melhor efetividade, tais como complexos contendo rutênio, gálio, ferro, titânio, ouro (LOKICH & ANDERSON, 1998; KOSTOVA, 2006; ALAMA et al., 2009). 1.6. Complexos de Rutênio e seu Mecanismo de Ação Em 1970, Clarke e colaboradores relataram que o rutênio (III) foi capaz de inibir a síntese de DNA e proteínas em células de carcinoma de nasofaringe in vitro, o que desencadeou o interesse em complexos de rutênio como potenciais fármacos anticancerígenos. Durante a década seguinte, Mestroni e colaboradores desenvolveram complexos hexacoordenados com Ru (II) dimetilsulfóxido e ligantes de cloreto, em particular os cis- e trans-RuCl2 (dimetilsulfóxido)4, que apresentam 46 atividade anticancerígenasin vitro e in vivo. Os complexos mostraram interagir tanto in vitro quanto in vivo com o DNA, seu alvo mais provável (PIZARRO et al., 2009). A partir dos trabalhos de Clarke e Mestroni há mais de 30 anos, uma grande quantidade de complexos de rutênio tem sido sintetizada e testada para avaliação de possível atividade antitumoral. Os compostos de rutênio formam compostos com os mais variados ligantes e apresentam química bem “estável”, o que amplia as possibilidades de aplicações biológicas. Os estudos com complexos de rutênio têm sido possíveis pela ampla variedade de coordenação, vários estados de oxidação (Ru (II), Ru (III) e Ru (IV)) em condições fisiológicas e a taxa de substituição de ligante (LEVINA et al., 2009). Os compostos de rutênio têm sido objetos de grande atenção por terem propriedades antimetastática e baixa toxicidade. A exploração de complexos de rutênio para o uso como agente antineoplásico foi iniciada na tentativa de se obter uma droga menos tóxica e mais específica. Ultimamente, complexos de rutênio como organometálicos têm demostrado interessantes propriedades antineoplásicas (HUXHAM et al., 2003; HARTINGER et al., 2006). Complexos de rutênio e de platina apresentam diferenças em sua estrutura. Os complexos de rutênio apresentam estrutura octaédrica, em contraste ao quadrado-planar do complexo de Pt (II), o que indica que o mecanismo de ação destes compostos deve diferir da cisplatina (SAVA et al., 1994; ALESSIO et al., 1997). Para esses complexos, estas características químicas proporcionam a formação de ligações fortes com o DNA, bem como para o NAMI-A (em triagem clínica fase II), estudos funcionais demonstram que a atividade biológica está relacionada à liberação progressiva dos íons cloretos (FRAUSIN et al., 2005; BERGAMO et al., 2012). O NAMI-A não mostra elevada citotoxicidade in vitro em linhagens de células tumorais, mas apresenta-se eficaz contra processos de metástases de câncer de pulmão e, atualmente, está sendo estudado para o uso como uma terapia de segunda linha contra NSCLC em combinação com o fármaco Gemcitabina (SAVA et al., 1995; HARTINGER et al., 2006). Estudos mostram ainda que o modo de ação destes agentes pode ser um dos motivos pelos quais complexos de rutênio, como KP1019 (em triagem clínica fase I), apresentam atividade anitumoral em neoplásias resistentes à cisplatina, apresentando atividade antitumoral contra carcinoma coloretal, induzindo aumento de ROS e morte celular via apoptose (PACOR et al., 2004; KAPITZA et al., 2005a; 47 HARTINGER et al., 2006; BERGAMO & SAVA, 2011). Apesar da estrutura e similaridades químicas, estes dois complexos de rutênio (III) (NAMI-A e KP1019) (Figura 9) apresentam distintas atividades antitumorais (PACOR et al., 2004; KAPITZA et al., 2005; ANTONARAKIS & EMADI, 2010). Figura 9 – Estrutura química dos compostos conhecidos como NAMI-A (H2im)[trans-RuCl4(Him)(DMSO)] (A), e KP1019 - Indazolium trans[tetrachlorobis(H1 indazole)ruthenate(III) (B). A B Fonte: VACCA et al., 2002 Os complexos de Ru (III) (NAMI-A e KP1019) têm sido extensivamente avaliados como potenciais agentes antitumorais (CLARKE et al., 2003; GIOVAGNINI et al., 2009). Outros complexos de Ru III como RM175, KP418, RAPTA-T, RDC-11 e DW1/2 (Figura 10) estão em estágio de testes pré-clínicos, assim como uma grande variedade de complexos de rutênio (II e III) com ligantes aminas, imina, polipiridil, DMSO e arenos. Alguns deles apresentam propriedades farmacológicas que instigam seus estudos (GIOVAGNINI et al., 2009; CHEN et al.,2010; LI et al., 2012). Uma dessas propriedades foi descrita por Clarke e Srivastava que descrevem os compostos de rutênio como fármacos que discriminam as células saudáveis das células cancerosas pelas suas caracteristicas, tais como: a hipóxia e o alto metabolismo celular requeridos pelo transporte de nutrientes a partir da maquinaria de transferrina apresentada pelas células cancerígenas (BERGAMO & SAVA 2011). Além dessas propriedades, outras caracteristicas são apresentadas pelos compostos de rutênio como o KP1019, que provavelmente não segue os atributos de ação da cisplatina, pois parece não agir sobre a maquinaria celular. Seguindo tal 48 raciocínio, a ação do RDC11 também segue outros fármacos à base de metal, apresentando várias reações de substiuição, assim como a quebra na regra de troca de ligantes. No entanto, sem dúvida o NAMI-A é o composto mais intrigante, por sua capacidade de agir sobre metástases (BERGAMO & SAVA 2011). Figura 10 - Estrutura química dos complexos de rutênio III Fonte: BERGAMO & SAVA, 2011 Complexos de rutênio (II) são foco de alguns estudos e apresentam resultados promissores como potenciais agentes tumorais. O composto α[RuCl2(azpy)2], no qualazpy = 2-fenilazo-piridina, apresenta elevada atividade contra as linhagens de células: MCF-7 (câncer de mama), EVSA-T (câncer de mama), WIDR (câncer de colo), IGROV (câncer de ovário), M19 (melanona), A498 (câncer renal) e H266 (câncer de pulmão) (HOTZE et al., 2000; VELDERS et al., 2000). Os complexos derivados do cis-[RuCl2(azpy)2] foram testados contra as linhagens de células A2780 (câncer de ovário humano) e A2780cisR (correspondente linhagem de célula resistente à cisplatina) e mostraram-se citotóxicos (HOTZE et al., 2000; VELDERS et al., 2000). 49 Diversos areno-complexos têm sido desenvolvidos como agentes anticancerígenos (ANG & DYSON, 2006), incluindo RAPTA-C ([RuCl2(η6-pcimeno)(pta)], no qualpta = 1,3,5-triaza-7-phosphaadamantano) (ALLARDYCE et al., 2001). Estudos indicaram que estes compostos, apesar de apenas moderadamente citotóxicos in vitro, apresentam alta seletividade; os compostos RAPTA-C101 e [RuCl2(η6-oluene)(pta)] (RAPTA-T)102 apresentam significante ação sobre o crescimento de metástase no pulmão. Os ligantes do tipo areno estabilizam Ru (II) conferindo um caráter hidrofóbico, o que pode aumentar o reconhecimento e transporte a partir da membrana celular (CLARKE, 2003). “Piano-stool” complexos organometálicos apresentaram citotoxicidade, contra a linhagem A2780 de câncer ovariano humano (MORRIS et al., 2001). Alguns complexos organometálicos, como [Ru(II)X(η6-areno)(YZ)], exibem atividade anticancerígena in vivo e in vitro (MORRIS et al., 2001; AIRD et al., 2002). A explicação aceitável para a atividade destes compostos é a ocorrência da hidrólise dos haletos, favorecida pelas condições imposta pelo meio biológico, e interação do aqua complexo formado com o DNA (HAYWARD et al., 2005). A citotoxicidade do composto mer-[RuCl3(terpy)] foi avaliada contra a linhagem de células L1210, apresentando ação significante menor que a da cisplatina, porém maior que a da carboplatina (VAN et al., 1995). Existem três propriedades principais do rutênio que fazem com que seus derivados sejam bem apropriados para aplicações biológicas: mudança de ligante – os complexos de rutênio Ru (II) e Ru (III) apresentam cinética de mudança de ligante similar aos complexos de platina (II), sendo importante para as fármacos atingirem o alvo biológico sem serem modificadas; estados de oxidação – o rutênio é um elemento entre o grupo de metais em que os estados de oxidação são acessíveis em condições fisiológicas, permitindo a administração de complexos de Ru (III) que poderão ser ativados por redução formando complexo de Ru (II) nos tecidos alvos. No sistema biológico, a redução de Ru (IV) e Ru (III) é favorecida pela glutationa, ascorbato e proteínas transportadoras de um único elétron, enquanto que o oxigênio e citocromo oxidase promovem a oxidação do Ru (II); mimetizando o ferro – a baixa toxicidade dos compostos de rutênio é explicada pela habilidade que este elemento tem de imitar o ferro na ligação a varias biomoléculas, incluindo a transferrina e a albumina. Em mamíferos, estas duas proteínas são responsáveis pela solubilização e transporte de ferro, reduzindo a toxicidade do metal (ALAMA et 50 al., 2009; PEREIRA et al., 2008; KOSTOVA, 2006; SILVEIRA-LACERDA et al., 2009b; ALLARDYCE & DYSON, 2001). Complexos de rutênio (II e III) em relação aos mecanismos de ação podem se ligar à molécula de DNA diferentemente do complexo de platina. As pesquisas sugerem que os complexos de rutênio promovem crosslinks entre as duas fitas de DNA, possivelmente favorecidos pelas restrições impostas pela geometria octaédrica destes compostos. Este mecanismo difere da formação de crosslinks intrafita induzida pela cisplatina e, conseqüentemente, as linhagens de células tumorais que têm desenvolvido resistência à cisplatina, pela aceleração da taxa de reparo de crosslinks intrafita, são ainda susceptíveis aos complexos de rutênio (ALLARDYCE & DYSON, 2001). Uma das hipóteses sugere que os compostos de rutênio (III) servem de prófármacos que reduzidas, in vivo, pelas condições citoplasmáticas das células tumorais: baixas concentrações de O2 em decorrência do consumo atípico de nutrientes; pH baixo, devido à produção de ácido láctico na glicólise anaeróbia, compensatória da falta de oxigênio e à presença de glutationa em níveis tipicamente altos. Essas alterações no ambiente citoplasmático das células tumorais podem favorecer a conversão de Rutênio (II) a partir do Rutênio (III), intensificando ligações ao DNA, com toxicidade seletiva às células tumorais (Figura 11) (CLARKE, 2003; SILVEIRA-LACERDA, et al., 2009b). Estudos de interação in vitro com nucleotídeos resultaram na ligação entre rutênio e DNA, o que ocorre principalmente no N7 da guanina entre “clusters” na dupla hélice (KÜNG et al., 2001) sendo, neste caso,semelhante às fármacoss à base de platina, nas quais a ligação com o DNA ocorrem preferencialmente a partir do N7 da guanina (GALLORI et al., 2000; CHEN et al., 2003). De maneira geral, complexos de rutênio podem se ligar ao DNA por meio de ligações eletrostáticas, intercalações, ligações covalentes e não-covalentes (ZHANG et al., 2010; LIU et al., 2010; MORENO et al., 2011). Além de interagirem diretamente com a molécula de DNA, pesquisas atuais apontam que complexos de rutênio (II) podem também inibir a atividade de topoisomerases, por meio de ligações diretas a topoisomerases I e II e interferências na religação do DNA. Esta interferência de complexos de rutênio a topoisomerases pode levar a interrupção na maquinaria celular envolvida na replicação e transcrição (GAO et al., 2007; DU et al., 2011) (Figura 12). 51 Figura 11 –Mecanismo de ação do rutênio no ambiente da célula tumoral Fonte: adaptado de CLARKE, 2003 A partir do desenvolvimento de vários estudos, observou-se que o principal alvo de alguns complexos de rutênio não é o DNA. Estudos têm demonstrado que existem mecanismos induzidos pelos complexos de rutênio (III) (por exemplo, o NAMI-A) independentes do DNA. Como inibição de metaloproteases, a interferência com processos de adesão e metabolismo do óxido nítrico são responsáveis pelos efeitos antitumorais de alguns complexos de rutênio. Nestes estudos, tem se observado que apesar de NAMI-A poder interagir com o DNA in vitro, a ligação ao DNA não parece contribuir para o seu efeito antimetastático (PLUIM et al., 2004). Estes estudos demonstram, ainda, que o NAMI-A, apresenta mecanismo de ação independente do DNA, demonstrando exercer seu efeito antimetastático possivelmente pela atuação sobre moléculas de adesão e metabolismo do óxido nítrico (MORBIDELLI et al., 2003; SAVA et al., 2003; PACCOR et al., 2004). 52 Figura 12 – Provável Mecanismo de ação de compostos de rutênio (II) no ambiente da célula tumoral Fonte: adaptado de BERGAMO & SAVA 2010 O composto de rutênio (II) areno RAPTA-T é outro exemplo de complexo de rutênio II que apresenta atividade antimetastática e sua atividade não está relacionada à interação com o DNA. A atividade deste composto está relacionada a interações com proteínas da superfície e matriz extracelular similar ao NAMI-A (BERGAMO et al., 2008). 1.7. Complexos de rutênio (II) Nos últimos anos, o desenvolvimento de complexos de rutênio (II) como agentes anticancerígenos tem aumentado nas pesquisas, exibindo atividade promissora, tanto em estudos in vivo como in vitro. Estes complexos mostram evidências de baixa citotoxicidade e toxicidade, mecanismos de ação alternativos e um espectro variável de atividade contra diversos tipos de câncer (AIRD et al., 2002; YAN et al., 2005; CHELOPO et al., 2013). Promissores resultados são observados nos complexos de rutênio (II) coordenados a aminoácidos, coordenados com N-Heterocíclicos, destacando-se também os ligantes piridínicos e bipiridínicos, bem como os N-doadores como 53 fenantrolina, piridina e imidazole. Sendo que os resultados frente à célula cancerígena dependem do tipo de ligante acoplado ao complexo (AIRD et al., 2002; YAN et al., 2005; CHELOPO et al., 2013). Ligantes como o N-heterocíclicos tem ganhado destaque. Uma das características destes compostos é a possibilidade de mimetizar moléculas biológicas que possuam propriedades particulares no metabolismo: ácidos nucléicos, proteínas, enzimas, alcalóides, etc. Um aumento nos estudos deste ligante se deu a partir de seu envolvimento com catálise redox e reações de transferência eletrônica. Dentre os ligantes N-Heterocíclicos, podem-se destacar os ligantes piridínicos e bipiridínicos, em especial, o ligante 2,2’-bipiridina e seus derivados. (JURIS et al., 1988; KAIM e SCHWEDERSKI, 1995). A bipiridina é derivada do acoplamento de dois anéis piridínicos e pode existir na forma de seis isômeros, um dos quais a 2,2´-bipiridina, que destaca-se por ser um ligante quelante formador de compostos de coordenação relativamente estáveis com a maioria dos íons de metais de transição. Eles estabilizam espécies de alto e baixo estado de oxidação. Por esta razão, estão entre os ligantes mais estudados na química de coordenação resultando em complexos estáveis. Ligantes bipiridínicos são excelentes na construção de complexos metálicos, de fórmula geral [M(bpy)3] e [M(bpy)2], que vai depender da geometria de coordenação preferencial do centro metálico (LE BOZEC & RENOUARD, 2000; MORENO et al., 2003). Rutênios com ligantes aromáticos N-doadores também exibem propriedades anticâncerígenas promissoras. Tais ligantes incluem derivados de fenantrolina, piridina e imidazole. Ligantes apresentando pelo menos uma porção NH em complexos de rutênio (II) facilitam uma interação efetiva com o DNA a partir de ligações de hidrogênio. Estes complexos apresentam diferentes modos de ligação à molécula de DNA e exibem uma excelente atividade anticancerígena em cânceres resistentes à cisplatina, em sistemas in vitro e in vivo (CHEN et al., 2003; ZHAO e LIN, 2005) A presença de um ligante quelante nos complexos de rutênio (II) oferece estabilidade estrutural, além da oportunidade de "afinar" a eletrônica no centro do rutênio. Diferentes elementos doadores tais como o fósforo, azoto e oxigênio, também estão sendo estudados quanto a sua atividade anticancerígena quando coordenados ao rutênio. Fernandez e colaboradores (2004) demonstraram que uma mudança de um ligante doador tem um efeito profundo sobre as propriedades 54 eletrônicas do complexo Ru (II). Como exemplo, podemos citar a taxa de hidrólise da ligação Ru-Cl como maior com um ligante quelante-O,O aniónico que com um ligante-N,N neutro. Esta “afinação” do ligante também resulta em uma mudança de preferência das nucleobases alvos. Estudos subsequentes estabelecem que os complexos de rutênio (II) com vários sítios de doadores quelantes foram realizados em ligantes tais como a N,N-(diaminas e bipiridina), N,O- (amino acidates) e O,O(acetilacetonato), em que os complexos de estudo com ligantes-N,N possuíam atividade superior a dos quelantes O,O; os complexos-N,O foram inativos. Os ligantes N,N têm sido extensivamente estudados na literatura, sendo os doadores quelantes preferidos na combinação com o heteroátomo doador. (Habtemariam et al, 2005; DOUGAN et al., 2008) 55 2. JUSTIFICATIVA Nos últimos anos, o interesse por novos fármacos antitumorais baseados em metais vem crescendo devido aos bons resultados obtidos por grupos de pesquisa. Estudos revelam que os complexos de rutênio apresentam uma incrível capacidade de inibir a mitose, o que pode estar relacionado à inibição da síntese de DNA, ao bloqueio do ciclo celular ou até mesmo aos processos de expressão gênica. A habilidade de modular o recebimento e a liberação de mensageiros celulares e outras moléculas intercelulares, como o Ca2+, revela que as ações realizadas pelos complexos de Ru II e Ru III na célula podem ser mais complexos e amplos do que se espera, abrindo um importante caminho para o entendimento dos mecanismos pelos quais os complexos de coordenação desempenham suas atividades no ambiente celular, conhecimento este que é crucial para o sucesso da aplicação clínica destes complexos. As pesquisas realizadas com complexos de rutênio (II e III) vêm apresentando bons resultados de acordo com a literatura. Estes complexos são interessantes por apresentarem, principalmente, atividade antitumoral, o que leva à necessidade de uma avaliação mais profunda e detalhada, a fim de compreender as diferentes propriedades químicas e biológicas desses novos compostos. Os resultados promissores divulgados e a possibilidade de trabalhar com novos ligantes exigem a realização de estudos a fim de entender a ação biológica desses compostos, como o mecanismo da cinética do ciclo celular, a via de morte celular e sua estabilidade genômica, com o objetivo de desenvolver fármacos com atividade mais acentuada e toxicidade diminuída. O grupo de pesquisa do Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, em parceria com laboratórios de química de outras Universidades, vem desenvolvendo trabalhos com complexos de rutênio (II e III). Os complexos de rutênio (III) já vêm sendo trabalhado pelo grupo desde 2008 e vêm apresentando resultados muito promissores com complexo de rutênio (III) com ligante amina, nos quais verificou-se sua atividade citotóxica in vitro frente a diferentes linhagens celulares, tais como K562 (Leucemia Mielóide Crônica), SKBR-3 (Carcinoma de mama), A-20 (Linfoma murino) e S180 (Sarcoma 180 murino). Além de apresentar atividade in vitro, estudos prévios demonstraram que este mesmo composto 56 apresentou atividade antitumoral in vivo sobre tumor Sarcoma 180 murino (S180) e, também, aumentou o tempo de vida dos animais tratados com este composto. Os complexos de rutênio (II) vêm sendo trabalhados pelo grupo de pesquisa há menos tempo, desde o ano de 2010. Vários complexos de rutênio (II) estão sendo testados em diferentes modelos de células tumorais humanas e murinas. Complexos de rutênio (II) coordenados a benzonitrila, bipiridina, ácido picolínico e pirimidina foram testados. Em estudos de triagem, apresentaram promissores resultados frente a vários carcinomas, com atividade superior ou semelhante ao agente antitumoral cisplatina. Diante destas perspectivas, são necessárias maiores investigações do mecanismo de ação destes compostos de rutênio. Estes testes tornam-se importantes para adefinição do potencial clínico destes complexos, contribuindo assim para o desenvolvimento de novos fármacos antitumorais, com propriedades complementares àquelas exibidas pelos já utilizados na clínica atual. 57 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GERAL O objetivo geral do presente estudo é avaliar o mecanismo de morte utilizando novos compostos de coordenação à base de Rutênio (II) e (III), em diferentes linhagens celulares in vitro. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Realizar a triagem do complexo de rutênio (III) frente à linhagem celular K562 (leucemia mielóide crônica); realizar a triagem em uma série de complexos de rutênio (II) coordenados a benzonitrila, bipiridina, ácido picolínico e pirimidina frente à linhagem tumoral S180 (sarcoma murino S180), DU145 (câncer de prostata), K562 (leucemia mieloide crônica) and A549 (câncer de plumão) e linhagem normal de PBMC (células mononucleares do sangue periférico), e selecionar um dos complexos para os ensaios seguintes pelo Indice de Seletividade;  Avaliar o efeito genotóxico do complexo de rutênio (III) sobre o DNA;  Avaliar se o complexo de rutênio (III) causa apoptose observando se houve quebra de DNA;  Avaliar o efeito do complexo de rutênio (II e III) sobre a cinética do ciclo celular;  Avaliar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre a indução de morte celular apoptótica ou necrótica;  Avaliar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre a atividade de casp3, casp8 e casp9;  Avaliar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre o potencial de membrana mitocondrial;  Avaliar o efeito do complexo de rutênio (II) sobre a expressão dos genes próapoptóticos Casp3, Casp8, Casp9, Tp53 e Bax, por real time q-PCR. 58 4. METODOLOGIA A metodologia do trabalho foi desenvolvida de acordo com o fluxograma abaixo: 4.1. Síntese dos Compostos de Rutênio O composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) foi sintetizado no Laboratório de Química do Instituto de Química da Universidade Federal de Uberlândia. Já os complexos de rutênio (II) coordenados a benzonitrila, bipiridina, ácido picolínico e pirimidina foram sintetizados no Laboratório de Química do Instituto de Química da Universidade Federal de São Carlos pelo professor Alzir Azevedo Batista e encaminhados ao Laboratório de Genética Molecular e Citogenética da Universidade Federal de Goias(UFG) para realização dos ensaios de atividade biológica. 59 Tabela 3 – Complexos de Rutênio II e III utilizados no desenvolvimento do trabalho. Complexos de Rutênio(II) Complexos de Rutênio (III) [Ru(prm)(bipy)(dppf)]PF6 [Ru(prm)(bipy)(dppm)]PF6 [Ru(prm)(bipy)(dppp)]PF6 [Ru(prm)(bipy)(dppe)]PF6 [Ru(prm)(bipy)(dppb)]PF6 [Ru(dmpm)(bipy)(dppf)]PF6 [Ru(dmpm)(bipy)(dppm)]PF6 [Ru(dmpm)(bipy)(dppp)]PF6 [Ru(dmpm)(bipy)(dppe)]PF6 [Ru(dmpm)(bipy)(dppb)]PF6 [Ru(pic)(bipy)(dppe)]PF6 [Ru(pys)(bipy)(dppp)]PF6 [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 [Ru(bcn)(bipy)(dppf)]PF6 cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) 4.2. Droga antitumoral controle Como controle positivo, utilizou-se o fármaco Cisplatina (5 a 50 µM), carboplatina (50 µM) e placlitaxel (25 µM) todos liofilizados, obtida comercialmente da Sigma (Sigma-Aldrich Co St Louis, MO, EUA). 4.3. Preparação dos compostos de Rutênio para ensaios biológicos in vitro O composto Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) liofilizado foi pesado e dissolvido em meio de cultura RPMI 1640 ou DMEN suplementado com 10% de soro bovino fetal na concentração de 2mg.mL -1 (Solução estoque, solução uso 0,1 à 200 µM). Os complexos de rutênio (II) coordenados a benzonitrila, 60 bipiridina, ácido picolínico e pirimidina foram dissolvidos em DMSO 100% para a solução mãe. Posteriormente foi submetido a um ultra-som para dissolução completa e então o composto foi esterilizado por filtração em membranas de 0,22 µm. Como controle positivo foram utilizados os fármacos Cisplatina (50 µM), Carboplatina (50 µM) e Paclitaxel (25 µM) para os testes de MTT e Azul de Tripano. 4.4. Meio de cultura celular Para a manutenção das linhagens de células tumorais, a dissolução dos compostos testados e a realização dos ensaios biológicos seguiram o protolocolo indicado pelo American Type Culture Collection (ATCC ROCKVILLE, MARYLAND, EUA) utilizando-se meio RPMI-1640 ou DMEM (SIGMA, ST. LOUIS, MO, EUA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (GIBCO®, INVITROGEN, CARLSBAD, CA, EUA) e 1% de glutamina, eritromicina e estreptomicina (Sigma) em estufa com 5% de CO2 a uma temperatura constante de 37ºC. 4.5. Linhagens celulares tumorais e normais Foram utilizadas às seguintes linhagens tumorais: S180 (sarcoma murino 180) (ATCC® TIB-66), A549 (câncer de pulmão humano) (ATCC® CCL-185), DU145 (câncer de prostata) (ATCC® 64963), K562 (leucemia mieloide crônica) (ATCC® CCL-243) provenientes do American Type Culture Collection (ATCC ROCKVILLE, MARYLAND, EUA). As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram coletadas de voluntários saudáveis com idades entre 20-30 anos, sem histórico de fumar, beber, ou o uso crônico de fármacos. O protocolo (043/2007) para estes experimentos foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de Goiás e, antes de entrar para o estudo, todos os doadores de sangue assinaram um termo de consentimento informado. 4.6. Cultura de células tumorais As células tumorais foram cultivadas em frascos para cultivo celular estéreis com 75 e 175 cm2, contendo meio RPMI 1640 ou DMEN (de acordo com a característaca de cada linhagem), acrescentado de glutamina 2 µmol L-1, 61 bicarbonato de sódio 10 mmol L-1 e soro fetal bovino 10% (v/v), seguindo o protocolo da ATCC (American Type Culture Collection). Para fins experimentais, as células foram cultivadas em microplacas de 96 poços, fundo chato com tampa, na presença ou ausência da cisplatina, de Ditionato de cis- Tetraamino(oxalato)rutênio(III) e complexos de rutênio (II) coordenados a benzonitrila, bipiridina, ácido picolínico e pirimidina conforme as concentrações descritas anteriormente. As células foram incubadas em estufa a 37ºC com atmosfera contendo 5% de CO2. Para a realização dos ensaios, previamente as linhagens tumorais aderentes em fase de crescimento logarítmico foram removidas dos frascos de cultura celular pela adição de 1 mL de tripsina 0,5% em solução tampão Fosfato 0,01 mol.L -1, pH 7,2 em solução salina 0,9% (PBS). Os frascos com solução de tripsina foram então mantidos sob agitação manual por aproximadamente 60 segundos. Em seguida, foram adicionados 10 mL de meio completo para neutralizar a tripsina e transferidos para tubos plásticos. Para células em suspensão, as mesmas foram retiradas diretamente das garrafas e transferidas para tubo Falcon para procedimento de lavagem. As células foram lavadas três vezes por meio da centrifugação a 1000 rpm por 10 minutos em meio completo. Ao final da última lavagem, as células foram ressuspendidas em 5 mL de meio RPMI completo. Uma alíquota de 10µL da suspensão celular foi colocada em 90 µL de Azul de Tripano 1% (m:v) (SIGMA-ALDRICH CO ST LOUIS, MO, EUA) e contadas em hemocitômetro (Câmara de Neubauer). 4.7. Método de redução do tetrazólio (Teste MTT) Para avaliar a atividade citotóxica e antitumoral dos compostos de coordenação de Rutênio (II) e (III), assim como determinar suas respectivas IC50 foi utilizado o método colorimétrico do MTT. O princípio deste método descrito por Mosman (1983) consiste em medir indiretamente a viabilidade celular pela atividade enzimática mitocondrial das células vivas. Para o teste do MTT, 2×103 de células foram semeadas em microplacas de 96 poços na presença dos compostos de Rutênio (II) e (III) por 48 e 72 h em estufa a 37ºC com atmosfera contendo 5% de CO2. Ao final do período de incubação, foi adicionado aos poços de cultivo celular, 10 μL de MTT na concentração de 5mg.mL-1, e após 3 h de incubação com o MTT, 62 foram acrescentados 50 μL SDS a 10% diluído em HCL/0,01N. A quantificação da densidade óptica (DO) foi medida em espectrofotômetro (AWARENESS TECHNOLOGY INE/ STAT FAX 2100). A porcentagem de viabilidade celular foi determinada a partir da seguinte fórmula: % Viabilidade = (Absorbância do Tratamento/Absorbância do controle negativo) × 100%. Após a triagem dos complexos de Ru II, o melhor composto foi designado como o que exibiu o menor valor de IC50 para as linhagens tumorais em relação a células saudáveis, assim pode-se dar continuidade aos outros ensaios sobre o mecanismo de morte celular. A IC50 foi usada para determinar o índice de selectividade (IS), para todos os complexos de ruténio (II), com a seguinte fórmula : IS = IC50 da célula não tumoral (PBMC) / IC50 da célula tumoral , e foi considerado significativo o IS ≥ 2.0 (OSTI et al. 2012). 4.8. Ensaio de citotoxicidade pela técnica de Azul de Tripano A citotoxidade após exposição a fármacos pode ser medida pela exclusão de corantes supravitais como o azul de tripano. O princípio deste teste consiste em medir indiretamente a viabilidade celular através da integridade de membrana, onde as células mortas que apresentam a membrana danificada absorvem este corante e consequentemente coram-se em azul, já as células vivas permanecem intactas sem coloração (PERES & CURI, 2005). Para o ensaio de azul de tripano, foram realizados os mesmos procedimentos de plaqueamento para o complexos de rutênio (III) sobre a linhagem K562 semelhantes ao realizados no ensaio do MTT. No entanto, ao final do período de incubação, alíquotas de 10 μL de suspensão celular foram colocadas em 40 μL de azul de tripano à 0 ,4%, e desta solução foi retirada uma alíquota para contagem de células em câmara de neubauer. Para determinar a porcentagem de citotoxicidade foi utilizada a seguinte fórmula % Citotoxidade= (100 - Absorbância do Tratamento/Absorbância do Controle Negativo*100). Ambos os ensaios MTT e Azul de tripano foram utilizados para calcular o valor da IC50. Para os ensaios foram realizados três experimentos independentes feitos em triplicata. 4.9. Eletroforese em gel de agarose A célula da linhagem tumoral foi incubada com diferentes concentrações da droga em estudo durante 48 h, em estufa úmida, com 5% de CO 2 no ar. Uma 63 quantidade de 2×106 células foram tratadas com diferentes concentrações de cis[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (de 0,15 a 150 µM) por 24 horas a 37 °C e 5% CO2. As células foram então retiradas do tratamento e centrifugadas a 300×g/15 min/10C e lavadas com PBS. As células foram então ressuspendidas a uma concetração de 1×106 cells mL-1 em um tampão de extração (Tris-HCl a 1 molar, Na2EDTA a 2 molar, 0,5mg L-1 de SDS) e tratadas com 20 mg L-1 de RNase A a 37°C por 60 minutos. Passado o tempo, as células foram então incubadas com proteinase K (100 mg L-1) a 37°C por 60 minutos. Depois da digestão por proteinase K, foi adicionada solução salina (NaCl a 6 M) e centrifugada a 13,000×g por 10minutos. O sobrenadante foi então coletado e um volume igual de etanol (-20°C) foi adicionado. As amostras foram então centrifugadas a 13,000×g por 30 minutos a 4C. O sobredante foi então discartado e os pellets dissolvidos em tampão TE (1×) e guardados em ultra-freezer (-80°C) até o momento de uso. A concentração de DNA foi detectada por UV utilizando um espectrofotômetro (Beckman DU-640, EUA). O DNA (5 µg por tubo) foi transferido para um gel de agarose a 1,5%, que foi submetido a uma eletroforese a 100V cm-1 por 90 minutos. O DNA nos géis foram visualizados através de transiluminação por ultravioleta, após a coloração por brometo de etídio (5 µg mL-1) utilizando um sistema de imageamento Omega® (UltraLum Inc., Claremont, CA, EUA). 4.10. Ensaio cometa O ensaio cometa é um método versátil e sensível para a detecção de quebras de fita simples e dupla no DNA. Ele tem sido amplamente utilizado como uma ferramenta para avaliações das respostas celulares aos danos no DNA, podendo ser aplicado em estudos de genotoxicidade, biomonitoramento, ecotoxicológicos e ainda em alguns estudos que envolvem saúde humana (TICE et al., 2008). Umas das maiores vantagens do Ensaio Cometa é a possibilidade de sua aplicação em diferentes tipos celulares que não necessariamente estejam em proliferação, tanto in vitro quanto in vivo (COLLINS et al.,1997; TRZECIAK et al., 2008). A versão alcalina do cometa (single-cell gel electroforesis) foi seguida de acordo com Singh et al., (1988), com pequenas modificações. A linhagem celular foi quantificada e depois foi tratada com concentrações diferentes do Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III), controle positivo 64 (Cisplatina) e negativo, por 24, 48 e 72 horas e então homogeneizados e misturados em agarose low-melting (baixa fusão) e imediatamente colocada em uma lâmina que já continha uma camada de gel de agarose a 1%. A lâmina com as duas camadas de agarose foi colocada a 4°C por 5 minutos. Após foram incubadas em uma solução de lise (2,5M NaCl, 10mM Tris, 100mM EDTA, 1% Triton X-100 and 10% DMSO, pH10,0) e colocada a 4°C por duas horas para remover proteínas e membranas. Posteriormente, as lâminas foram colocadas na eletroforese com tampão (300mM NaOH, 1mM EDTA, pH > 13,0). A corrida de eletroforese foi por 20 minutos, a 0,9 V/cm, 300 mA e a 4°C. Todo o procedimento foi realizado no escuro ou sob luz amarela, de forma a prevenir danos ao DNA. As lâminas foram mergulhadas em solução de neutralização (0,4M Tris, pH 7,5), lavada com água destilada e secas a temperatura ambiente. As lâminas foram preparadas em duplicatas e 100 núcleos analisados (50 núcleos para cada duplicata) utilizando microscópio de fluorescência (Leica) equipado com filtro de excitação de 515-560nm, um filtro de barreira de 590nm, e objetiva de 40x. Os núcleos sem danos no DNA apareceram intactos e sem cauda. Os cometas foram classificados pelo software CometScore 15, em classes: ausência de cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça (classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da cabeça (classe 2): cauda maior que duas vezes o diâmetro da cabeça (classe 3) e sem cabeça (classe 4). As recomendações para o ensaio cometa consideram tanto avaliações visuais quanto as avaliações usando software (BURLINSON et al., 2007). O total da contagem dos danos foi de 100 por amostra, perfazendo um total de 500 núcleos (desde a classificação 0 – sem danos – até classificação 4 – danos totais). 4.11. Análise da Cinética do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo As fases do ciclo celular podem ser caracterizadas por variações no seu conteúdo de DNA, que quando analisado por citometria de fluxo após marcação com iodeto de propídeo permite quantificar a percentagem de células em cada fase do ciclo celular. Para esta análise, 5 x 105 células tumorais foram plaqueadas em microplacas de 12 poços na presença ou ausência dos complexos de rutênio (II) e (III). Após exposição das células aos complexos de rutênio, estas foram 65 centrifugadas e em seguida lavadas com PBS. Ao final da lavagem o sobrenadante foi desprezado, e o “pellet” celular foi incubado com 1 mL de álcool etílico gelado (70%) por 24 h a -20°C. Ao final da incubação as células foram lavadas novamente com PBS e em seguida estas foram incubadas por 15 min em uma solução contendo ribonuclease A (RNAse A) 0,05% e iodeto de propídio (50 µg mL-1). A análise da porcentagem de células em sub-G1, G0/G1, S, G2/M e foi realizada em citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences), através do software ModFit. 4.12. Avaliação de apoptose e necrose por coloração com Anexina V/PI A externalizaçao de fosfatidilserina na superfície externa da membrana plasmática é um dos primeiros eventos que ocorre na superfície de uma célula em processo de apoptose ou de necrose, sendo que esta perda de assimetria do fosfolipídeo de membrana contribui para facilitar o reconhecimento por protreínas dependente de ións cálcio, como a Anexina V (BOERSMA et al., 2005; GALLUZI et al., 2012). O procedimento de detecção de apoptose e necrose por Anexina VFITC/Iodeto de Propídio consiste na ligação da anexina V-FITC à fosfatidilserina, na membrana das células que estão iniciando o processo apoptótico ou necrótico, e na ligação do iodeto de propídeo ao DNA das células no processo final da apoptose. Para detecção de apoptose e necrose foi utilizado o Kit de detecção de apoptose Anexina V/Iodeto de Propídio (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) de acordo com as instruções do próprio fabricante. Para este ensaio 5 x 10 5 células foram semeadas em microplacas de 12 poços e incubadas na ausência ou presença dos complexos rutênio (II) e (III). Após tratamento com os complexos de rutênio as células foram centrifugadas e posteriormente lavadas com PBS. O sobrenadante foi descartado e ao pellet celular foi adicionado 400 µL de tampão de ligação e em seguida acrescentados 5 µL de Anexina V-FITC e 1 µL de iodeto de propídio. As células foram então incubadas em temperatura ambiente por 15 min, e posteriormente foi feito à aquisição dos dados em citômetro de fluxo (FACSCallibur, BD Biosciences). Para análise dos dados foi utilizado o software Cell Quest. Foram classificadas como células em apoptose inicial aquelas com marcação somente para Anexina-V (AN+)/(PI-), e como células em apoptose tardia aquelas com dupla marcação de Anexina V e PI (AN+)/(PI+), células em necrose somente marcação para PI (AN-)/(PI+) e células viáveis não apresentam nenhuma marcação. 66 4.13. Análise Bcl2 por citometria de fluxo Após o tratamento das células com o complexo rutênio (II) por 24 horas nas concentrações determinadas as células foram retiradas da cultura, transferidas para um tubo de citometria de fluxo e centrifugas a 1800 rpm por 3 min. Descartado o sobrenadante as células foram lavadas com PBS 1X e novamente centrifugadas. Descartado o sobrenadante elas foram re-suspendidas em 500 µL de tampão de lise por 10 min. em temperatura ambiente (20° a 30°C). Após este período as células foram novamente centrifugadas e o sobrenadante removido. Adicionado 500 µL da solução de permeabiliazação e após 10 min, centrifugadas e o sobrenadante descartado. Foram então lavadas com tampão BSA (PBS 1X, 0,5% de SFB e 0,1% de azida de sódio), centrifugadas e o sobrenadante descartado. Adicionou-se 20 µL do reagente anti-Bcl-2. O tubo foi mixado e incubado por 30 min. a temperatura ambiente (20° a 30°C). Após o tempo de incubação as células foram centrifugadas, o sobrenadante descartado e novamente lavadas com BSA. Foram re-suspendidas em 500 µL de BSA e levadas para a análise leitura no citometro de fluxo (FACSCallibur, BD Biosciences). 4.14. Análises da ativação de caspases pelo ensaio colorimétrico Para investigação da ativação das Casp3, 8 e 9 após o tratamento com o complexo de rutênio (II) foi utilizado o Kit de proteases colorimétrico ApoTarget™(Invitrogen) de acordo com as instruções do próprio fabricante. O ensaio de atividade das caspases é baseado na detecção por espectrofotômetro do cromóforo p-nitroanilima (pNA) depois da clivagem do substrato X-pNA, onde X é a seqüência de aminoácidos reconhecida pelas caspases. Neste ensaio, 3 x 10 6 células foram semeadas em garrafas de cultura 25 cm 2 e incubadas por período de 24 horas na ausência ou presença do complexo de rutênio(II). Após incubação as células foram inicialmente centrifugadas e o pellet de células formado foi incubado com de tampão de lise em banho de gelo por 10 min. A concentração de proteínas foi medida por meio do ensaio BSA (BioRad). 75 µg do extrato de proteína, 50 µL de tampão de reação 2X suplementado com 10 mM de DTT e os substratosDEVD-pNA (Casp3), IETD-pNA (Casp8) e LEHD-pNA (Casp9) foram incubados por 2 horas a37°C. Após incubação por 2 horas, a formação de p-nitroanilide nas amostras foi 67 medida em espectrofotômetro (Awareness Technology INE/ Stat Fax 2100) a 405 nM. O aumento da atividade de Casp3, Casp8 e Casp9 foram determinados por meio da comparação dos resultados com o controle. 4.15. Ensaio do potencial de membrana mitocondrial JC-1 A perda do potencial de membrana mitocondrial é uma característica de apoptose, sendo que este evento precede a externalização fostatidilserina e coincide com a ativação de caspases. JC-1 (iodeto de 5,5`,6,6`-tetracloro1,1`,3,3`- tetraetilbenzimidazolocarbocianina), é um marcador fluorescente que mensura o potencial de membrana mitocondrial das células. Este corante, penetra na organela e emite fluorescência nos comprimentos de onda de luz vermelha (pico de emissão máximo 590 nm) ou verde (emissão 520 nm), de acordo com o potencial de membrana mitocondrial interna. Penetrando em altas concentrações, o corante apresenta-se na forma de j-agregado e emite coloração vermelha e, em baixas concentrações encontra-se na forma de monômero e emite coloração verde. Desta forma, em mitocôndrias funcionais, o JC-1 penetra e acumula-se no interior desta organela e emite coloração vermelha, ao passo que, mitocôndrias com baixo a médio potencial de atividade de membrana fluorescem verde (CHAZOTTE, 2011). O efeito dos complexos de rutênio(II) sobre o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) foi mensurado utilizando o corante catiônico JC-1 (BD Bioscience). Para o ensaio 3 x 105 de células foram tratados com complexo de rutênio (II) durante 24 h. Após tratamento as células foram centrifugadas por 10 min a 1500 rpm e lavadas com PBS. Após serem lavadas as células foram incubadas por 15 minuntos a 37°C com o corante JC-1. Em seguida as células foram lavadas novamente e ressuspendidas em tampão de ensaio para análise em citômetro de fluxo. Os resultados foram obtidos utilizando um citômetro de fluxo (FACSCallibur BD Bioscience) e a análise dos dados foi feita através do software Cell Quest, (BD Biosciences). 4.16. Avaliação da expressão gênica 4.16.1 Extração RNA O RNA total de células tratadas com complexos de rutênio (II) na 68 concentração de 24µM foi isolado utilizando-se o reagent Trizol (Sigma-Aldrich) seguindo as recomendações do fabricante. Para o isolamento, 1 mL de trizol foi adicionado ao pellet cellular e homogeneizado até a dissolução completa do pellet. Foram adicionados a seguir 200 µL de clorofórmio, e os tubos foram homogeneizados por inversão e deixados a temperatura ambiente durante dois minutos seguindo-se de centrifugação durante 15 min a 12.000 g a 4°C. Este procedimento resultou em três fases: a fase aquosa onde está o RNA, à interface que contém as proteínas e por fim a fase com fenol/clorofórmio. Após a transferência da fase aquosa para um novo tubo, foram adicionados 500 µL de álcool isopropílico para a precipitação do RNA. Este foi incubado em seguida por 5 min em temperatura ambiente. A seguir os tubos foram centrífugados a 12.000 g por 10 minutos a 4 °C. O RNA foi então lavado com etanol 75% e em seguida centrifugado por 10 min a 7500 g a 4°C. Após centrifugação foi descartado o álcool e os tubos foram colocados em capela para evaporação do álcool. Após evaporação completa do álcool o RNA foi dissolvido em 50 µL de água ultrapura. A seguir o material foi tratado com DNAse I (Sigma Aldrich) seguindo protocolo sugerido pelo próprio fabricante. Após tratamento com DNAse I o material foi estocado em -80°C. A concentração e o grau de pureza do material foram estimados em espectrofotometro NanoDrop (Thermo Scientific, Delaware, EUA). O grau de pureza foi avaliado de acordo com a relação 260/280. A qualidade (integridade) do RNA foi avaliado por meio de eletroforese em gel de agarose 1,2 %. 4.16.2 Síntese cDNA Para a síntese de cDNA utilizou-se o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Appyed Biossystems), seguindo as instruções do fabricante. Uma mistura contendo dNTPS, inciadores randômicos (random primers) e transcriptase reversa foi preparada e adicionada a um mesmo volume de RNA (2µg). A reação de síntese de cDNA foi realizada a 25°C por 10 minutos seguida de 2 horas a 42°C. 4.16.3 Real time PCR (qPCR) A avaliação da expressão do mRNA dos genes Casp3, Casp8, Casp9, Tp53 e Bax foi realizada por real time PCR utilizando o reagente Sybr Green Master Mix 69 (LGC Biotecnologia). Para reação foram utilizados 10 µL de master mix, 2 µL de cada primer (400 nM), 2 µL de cDNA final e 4µL de água. As amostras foram amplificadas no sistema Line Gene (Bioer Techology) com uma desnaturação inicial de 95° durante 15 min seguidos de 40 ciclos a 95°C durante 15 segundos, 55°C durante 15 segundos e por último 72°C durante 30 segundos. Em todas as reações foi realizada a curva de dissociação (melting) para verficar a presença de produtos inespecíficos. As sequências dos primer utilizados nesse ensaio são descritas na tabela 4 e foram dezenhadas com junção de éxon. A expressão relativa de cada gene-alvo foi normalizada utilizando a expressão dos genes de referência β actina para linhagem de camundongo S180. A expressão relativa foi realizada pelo método 2-∆∆CT. Para análise da eficiência dos primers foi realizada a curva padrão, em que foram utilizados os primers com valores de eficiências superiores a 90 %. A partir da curva padrão foram calculados o slope (-3,32) e o coeficiente de correlação (R2). Tabela 4 - Sequências de primers utilizados para o ensaio real time RT-PCR. Gene β actina Mus musculus Sequência do primer F5’CACACCCGCCACCAGTTC3’ R5’ATTCCCACCATCACACCCTG3’ (161pb) F5’GTGCTCGCGCTACTCTCTCT3’ R5’TCAATGTCGGATGGATGAAA3’ (143pb) F5’GCTACAGGGTTTCATCCAGG3’ R5’GGAGACACTCGCTCAGCTTC3’ (113pb) F5’GGAGCTTGGAACGCTAAGAA3’ R5’GTCCACTGACTTGCTCCCAT3’ (112pb) F5’CCTCTTCCCCCATTCTCATT3’ R5’CCAGAGTCCATTGATTCGCT3’ (122pb) F5’AGGTACTCGGCCACAGGTTA3’ R5’TGGGATGTAGTCCAAGCACA3’ (137pb) F5’TAGCTGGAACACTGGGCATTGAGT3’ R5’AACATACCCATCGGTGCATTTGGC3’(146pb) β globina Homo sapiens Bax Mus musculus Caspase 3 Mus musculus Caspase 3 Homo sapiens Caspase 8 Mus musculus Caspase 9 Mus musculus 70 Tp53 Mus musculus F5'-TGGAAGACTCCAGTGGGAAC-3' R5'-TCTTCTGTACGGCGGTCTCT-3' (87pb) 4.17. Análise Estatística Para comparação entre os grupos tratados e controle, foram utilizados Teste T Student e Análise de Variância (Anova), seguido de pós-teste Bonferrone (software GraphPad-Prism V4). Foram considerados como diferença significativa valores de p menores que 0,05 (p<0.05). 71 5. PRODUÇÃO CIENTÍFICA ARTIGO 1 - Citotoxic effects of the compound cis-tetraammine(oxalato)ruthenium(III) dithionate on k562 human erythroleukemia cells Autores – Flávia de Castro Pereira, Aliny Pereira de Lima, Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa, Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro, Lucas Carlos Gomes Pereira, Wanessa Carvalho Pires, Luiz Alfredo Pavanin, Wagner Bastita dos Santos, Elisangela de Paula Silveira-Lacerda Situação – Aceito pela Springer Plus ARTIGO 2 – Ruthenium [RuCl(bcn)(N-N)(P-P)]PF6 complexes: In vitro pre-clinical trials and a potential metallodrug against sarcoma S180 tumor cells Autores - Flávia de Castro Pereira, Aliny Pereira de Lima, Wanessa Carvalho Pires, Thallita Monteiro, Lorena Félix Magalhães, Wanderson Costa, Benedicto Augusto V. Lima, Angelica Ellen Graminha, Alzir Azevedo Batista, Javier Ellena, Elisângela de Paula Silveira-Lacerda Situação – Artigo a ser submetido a revista ≥ B1 PlosOne 72 5.1. ARTIGO 1 Cytotoxic effects of the compound cis-tetraammine(oxalato)ruthenium(III) dithionate on k562 human erythroleukemia cells Flávia de Castro Pereira1, Aliny Pereira de Lima1, Wanessa Carvalho Pires1, Alessandra de Santana Braga Barbosa Ribeiro1, Lucas Carlos Gomes Pereira1, Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa1, Luiz Alfredo Pavanin2, Wagner Batista dos Santos3, Elisângela de Paula Silveira-Lacerda1* 1-Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia, Goiás, Brazil; *Corresponding Author: silveiralacerda@gmail.com 2 - Instituto de Química, Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Uberlândia, Minas Gerais, Brazil; 3 - Instituto de Química, Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT, Barra do Garça, Mato Grosso, Brazil; *Autor Correspondente: Elisângela de Paula Silveira-Lacerda, e-mail: silveiralacerda@gmail.com Laboratório de Genética Molecular e Citogenética Instituto de Ciências Biológicas - ICB I - Sala 200 Universidade Federal de Goiás Campus Samambaia (Campus II) Cx. Postal: 131 Goiânia-GO, Brasil -74001-970 Telefone/Fax +55-62-3521-1481 Telefone Celular: +55-62-9293-3121 73 ABSTRACT: Chemotherapy is a common treatment for leukemia. Ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and photodynamic therapy. The identification of new chemotherapeutics agents is critical for further progress in the treatment of leukemia. Ruthenium complexes generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their specific accumulation in cancer tissues. Based on these evidences, in the present work we studied the citotoxic activity of the ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate - {Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human erythroleukemia (K562) tumor cell line. The antiproliferative and cytotoxic activity revealed that K562 cells cultured with concentrations 40 to 150 µM of ruthenium(III) compound showed significant reduction of proliferation after 72h of exposition, with viabilities ranging from 88.2% to 55.6% when treated with 40 µM for 24 to 72h; and 76.2% to 26.7% when treated with 150 µM for 24 and 72h. The ruthenium(III) compound induced low [22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to 35.7% (48h) for concentrations 10 and 40 µM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53% (48h) for concentration 150 µM] of cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h, the IC50 value was 18.28 µM. Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow cytometric analysis indicated a sub-G1 arresting effect of ruthenium compound on K562 cells, inducing a 1.7-fold, 2.2-fold and 2.4-fold increase in the number of sub-G1 cells for 24, 48 and 72 h, respectively, when compared to control. The compound also caused a significant increase in tailed cells in any of the concentrations tested compared with negative control, that can be associated cytotoxicity with direct effect on K562 cells DNA. Additional studies are needed to determine the molecular mechanisms of the active components and to evaluate the potential in vivo anticancer activity of the cis- tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) dithionate. Keywords: cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate; Cytotoxic activity; K562, Ruthenium(III) compounds; immunomodulatory activity, Apoptosis. 74 1. Introduction Leukemia is a major type of cancer affecting a significant segment of the population, and especially children. In fact, leukemia is the most frequent childhood cancer, with 26% of all cases, and 20% mortality [1]. The American Cancer Society (ACS) estimated that 47,150 new cases of leukemia would be diagnosed in the United States in 2012, whereas about 23,540 adults and children would die of leukemia during 2012 [2]. Although the incidence rate for this disease remains relatively unchanged, some success has fortunately been attained in its treatment. But even if the success of clinical trials in identifying new agents and treatment modalities has been significant, current treatments have many limitations related to their side effects and the development of acquired drug resistance [3] The new therapeutic agents thus needed should be more active and produce less side effects and they also should act through a mechanism different from that of cytotoxic agents already used [4,5]. Chemotherapy is a common treatment for leukemia [6]. In general the therapy uses a number of different anticancer drugs, which destroy cancer cells by preventing them from growing and dividing rapidly. Unfortunately, a number of the body's normal, non-cancerous cells (e.g., hair cells, red and white blood cells, blood-clotting platelets, and cells of the gastrointestinal mucosa) also divide rapidly and are harmed by chemotherapy [6,7]. The side effects of chemotherapy hamper many normal activities of patients undergoing treatment [7]. The preparations of metallo complexes with potential antitumor activity has been one of the main targets of transition metal chemistry since Rosenberg’s discovery of cisplatin {cis-diamminedichloridoplatinum(II), cis-[Pt(NH3)2Cl2]} cytotoxic activity in the 1960s [8]. In 1978, cisplatin was approved as the first platinum based drug for the oncology treatment, although several negative side-effects (nephrotoxicity, neurotoxicity, nausea, etc.) had been induced on treated patients [9]. Nevertheless, cisplatin was followed by carboplatin {cis-diammine-1,1´ - cyclobutanedicarboxylateplatinum( II), [Pt(NH3)2(cbdc)], approved in 1985} and oxaliplatin {1R,2R-diamminocyclohexaneoxalatoplatinum(II), [Pt(dach)(ox)], approved in 1996}, which met requirements of improving antitumor activity and reducing disadvantages of cisplatin, carboplatin and oxaliplatin represent the second, and third platinum-based drug generations, respectively ( [9,10]. Nowadays, not only platinum- 75 bearing complexes are extensively studied with the aim to broaden a spectrum of transition metal-based complexes which could be used in the treatment of cancer [10]. In addition to the other metal complexes cisplatin have been developed using heavy metals. For example, gold complexes have been developed for the treatment of rheumatoid arthritis, silver complexes as anti-microbial agents, antimony complexes for the treatment of leishmaniasis, vanadium(IV) complexes as antiviral and antidiabetic agents, arsenic trioxide (Trisenox) for the treatment of acute promyelocytic leukaemia, and metal-activated bleomycin for the treatment of Hodgkin’s lymphoma and testicular cancer.Transition-metal-based therapeutic agents currently under clinical trials include third generation antitumor platinum complexes such as liposomal cisplatin (Lipoplatin), satraplatin, and picoplatin, the antimalarial ferrocene–quinoline conjugate ferroquine [11]. Rhodium and Iridium has also been used for the synthesis of these metal complexes , as they allow greater selectivity and affinity molecules . The iridium (III) already shows results TNF- α in inhibiting HepG2 line through a hydrophobic binding [12,13]. These metal complexes possess many advantages that make them suitable for the development of new therapeutic agents and compounds of ruthenium has been highlighted why ruthenium complexes have shown potential utility in chemotherapy and photodynamic therapy [14,15]. Ruthenium complexes generally have lower toxicities compared to cisplatin attributed to their specific accumulation in cancer tissues [16]. In vitro and in vivo studies show high anticancer activity of ruthenium complexes and some of them are currently undergoing clinical trials [17,18]. The identification of new chemotherapeutics agents is critical for further progress in the treatment of leukemia. In comparison to the platinum(II) antitumor complexes currently used in the clinic, ruthenium compounds offer potentially reduced toxicity, a novel mechanism of action, the prospect of non-cross-resistance, and a different spectrum of activity [14]. The reduced toxicity is in part due to the ability of ruthenium complexes to mimic the binding of iron to molecules of biological significance, exploiting the mechanisms that the body has evolved for non-toxic transport of iron [19]. This reduced toxicity, together with non-cross-resistance in cisplatin-resistant cancer cells, is particularly attractive attributes of these complexes [20]. 76 Based on these evidences, in the present work we studied the citotoxic activity of the ruthenium(III) compound cis-Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} against human erythroleukemia (K562) tumor cell line. 2. Results 2.1. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound reduces viability of K562 cells Results derived from Trypan blue staining essay revealed that K562 cells cultured with concentrations 40 and 150 M of ruthenium(III) compound showed significant reduction of proliferation after 72h of exposition, with viabilities ranging from 88.2% to 55.6% when treated with 40 µM for 24 and 72h; and 76.2% to 26.7% when treated with 150 µM for 24 and 72h Figure 2. 100 90 80 * * C e ll v ia b ility (% ) 70 60 50 40 30 20 10 0 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 24h 48h ) ) ) ) ) ) ) M M M ) M M M M iu 5 5 .5 0 0 0 0 d .1 1 (1 (4 5 5 .0 (1 (0 (1 M tin (0 d R R u R la u R a p lls rb (C (C C T r e a t m e n t { c i s - [R u (C 2 O 4 )(N H 3 ) 4 ] 2 ( S 2 O 6 )} Figure 2. Anti-proliferative activity of cis-tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line. The tumor cells were cultured in the presence or absence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.015 – 150 µM) for 24 h and 48 h as described in Material and Methods. The cell viability was assessed by correlation between the viable cells (that excluded trypan blue dye) and dead cells (stained cells) using a newbauer chamber. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs. negative control. C + C - + (P e a a cl R o ita n u R xe u u u l2 e 5 M m ) 77 2.2. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound presents cytotoxic activity towards K562 tumor cell lines To verify the cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on K562 cell lines, tumor cells were cultured for 24 and 48h in the presence of different concentrations of ruthenium compound. MTT reduction assay revealed that ruthenium compound produced concentration and time-dependent cytotoxicity effects on K562 cells. The results Figure 3 b show that the ruthenium(III) compound induced low [22.4% (24h) to 28.2% (48h) and 29.8% (24h) to 35.7% (48h) for concentrations 10 and 40 µM, respectively] to moderate [44% (24h) and 53% (48h) for concentration 150 µM] of cytotoxic activity against K562. After incubation for 48 h, the IC50 value was 18.28 µM (Figure 3 a). Figure 3. Cytotoxic activity of cis-tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate compound towards K562 cell line (a and b). The tumor cells were cultured in the presence or absence of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (0.15 – 150 µM) for 24 h and 48h as described in Material and Methods. The compound cytotoxicity was assessed by measuring the absorbance of dissolved formazan using a microplate reader. The reduction of yellow 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue, insoluble formazan only occurs in mitochondria of the living cells. The data show the mean±S.D. (standard deviation) of three independent experiments [GraphPad Prism version 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA)]. *p<0.05 vs. negative control. # = 0%. Dotted line = IC 50 concentration for 48h of treament. 78 2.3. The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) induced apoptosis in K562 cells as verified by DNA ladder analysis. The significantly reduced number of K562 cells in the presence of cistetraammine(oxalato)ruthenium(III) dithionate on previous assays suggests that this compound could be inducing cell death via apoptosis. To examine pro-apoptotic properties of the ruthenium(III) compound, K562 cells were cultured in the presence of different concentrations of ruthenium compound (from 0.15 – 150 µM) and then DNA ladder analysis was performed via agarose gel electrophoresis. K562 cells cultured in the presence of ruthenium compound but not in medium alone presented DNA fragmentation (Data not shown). 2.4 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) presents genotoxic effects against K562 tumor cells. The alkaline comet assay has been used to assess the possible genotoxicity of cis-tetraammine(oxalato)ruthenium(III) dithionate against K562 cells. Results indicate that K562 tumor cells cultured with ruthenium(III) complex show a significant increase in DNA damage index in any of the concentrations tested compared with negative control, in a dose-dependent manner (Figure 4). Results show an average DNA damage index of 59 for 10 µM, 140 for 40 µM, 176 for 150 µM when K562 tumor cells were exposed to ruthenium(III) for 24 h; and 108 for 10 µM, 154 for 40 µM and 197 for 150 µM, for 48 h of exposition. Thus, the concentration of cis[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) might be associated cytotoxicity with direct effect on K562 cells DNA (p<0.05). 79 400 DNA Damage Index 350 300 250 200 150 100 50 0 24h Control - (Cell and Medium) Ru (10 µM) Ru (40 µM) Ru (150 µM) C+ (Cisplatin 50 µM) * * * * * * * 48h Treatment {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} Figure 4. Induction of DNA strand breaks of K562 cells cultured in the presence of cis[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) compound. Cultures of K562 cells were exposed to increasing concentrations of ruthenium (III) complex for 24 and 48 h and submitted to SCGE-analysis. DNA damage index was measured as described in materials and methods section. Results in the figure represent the mean ±S.D. of 3 independent experiments using triplicate samples. *Increased above control at p<0.05. 2.5 The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) increased the number of K562 tumor cells in sub-G1 phase, an indicative of apoptosis. The cell cycle distribution of K562 cells treated with different concentrations of ruthenium compound (from 1.5 – 150 µM) for 24, 48 and 72h revealed a prominent increasing of cells on sub-G1 phase at concentration 40 and 150 µM and reduction on G0/1, S and G2/M phases. Figure 5 shows that treatment with 40 and 150 µM of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) for 24, 48 and 72h caused an increase in the proportion of cells in the sub-G1-peak correlating with fewer cells in G0/G1, S and G2/M. The fraction of sub-G1 cells increased from 34.5% in the control to 59% at 24h; 30.7% in the control to 68.6% at 48h; 35.5% in the control to 84.7% for 72h on cells treated with 40 µM of cis-tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) dithionate. The same effect 80 was observed when k562 tumor cells were treated with 150 µM of ruthenium(III) compound. The ruthenium(III) compound caused a minor S phase accumulation after incubation at concentrations of 40 and 150 µM for all periods of exposition Table 1. Figure 5. Cell cycle profile histogram of K562 cells treated with cistetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. Tumor cells were cultured with different concentrations of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 1.5 – 150 µM), maintained for 24, 48 and 72h h, and then collected, washed with PBS, and stained with propidium iodide as described in “Material and Methods” section. PI fluorescence was analyzed by flow cytometry (FACS Canto II, BD Biosciences, San José, CA, USA). 81 Table 1. Cell cycle analysis of K562 tumor cell lines after treatment with cistetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. Control Mean ±S.D 34.45 27.20 19.05 14.10 ±0.6 ±0.3 ±0.1 ±0.1 Ru 1.5 µM Mean ±S.D 30.20 25.25 27.50 14.85 ±2.1 ±2.1 ±1.1 ±0.8 Ru 10 µM Mean ±S.D 31.20 19.55 29.10 18.10 ±1.4 ±0.9 ±1.1 ±0.7 Ru 40 µM Mean ±S.D 59.00 11.50 18.60 9.15 ±2.3 ±1.7 ±2.1 ±1.6 Ru 150 µM Mean ±S.D 68.90 14.75 11.40 4.00 ±1.8 ±0.9 ±0.8 ±0.1 24 h SubG0/G1 G1 S G2 48 h SubG0/G1 G1 S G2 72 h SubG0/G1 G1 S G2 30.70 35.65 21.35 10.00 ±0.7 ±0.6 ±0.4 ±1.4 24.65 31.70 30.05 12.50 ±1.1 ±1.0 ±0.8 ±0.3 40.55 14.85 26.35 17.05 ±2.6 ±2.6 ±2.1 ±2.3 68.60 8.35 14.35 7.85 ±1.1 ±0.4 ±0.9 ±0.1 67.60 19.30 9.75 2.95 ±0.1 ±0.4 ±0.2 ±0.1 35.50 ±16.0 35.45 ±10.1 20.05 ±4.7 7.45 ±0.8 34.50 31.75 23.80 9.30 ±1.4 ±0.5 ±0.6 ±0.4 45.95 17.05 26.05 10.50 ±1.1 ±0.2 ±0.6 ±0.3 84.70 4.95 7.20 3.10 ±0.3 ±0.1 ±0.6 ±0.1 70.50 18.70 9.25 1.45 ±2.8 ±1.0 ±1.6 ±0.2 3. Discussion Apoptosis is an active physiological process resulting in cellular selfdestruction that involves specific morphological and biochemical changes in the nucleus and cytoplasm [25]. Agents that suppress the proliferation of malignant cells by inducing apoptosis may represent a useful mechanistic approach to both cancer chemoprevention and chemotherapy. While many anticancer agents have been developed, unfavourable side effects and resistance are serious problems [26]. Since the introduction of cisplatin in cancer therapy, metal complexes and organometallic compounds have been gaining importance in oncology [26, 27]. Metal-based compounds increase the possibility of developing molecules better-suited for binding to specific biological targets [27, 18]. Ruthenium complexes appear particularly promising; although they exhibit lower cytotoxicity as compared to cisplatin, they are better tolerated in vivo [27, 18, 4]. Research on bioactive ruthenium(II) complexes is very active [28]. These studies 82 have led to the development of ruthenium based anticancer agents [29,30,18]. Research groups of Sadler, Dyson, Keppler and Reedijk have synthesized a remarkably large number of Ru(II)/Ru(III) organometallic complexes that are being tested for anticancer activity. Ruthenium complexes are slitly cytotoxic but do not affect normal cells significantly. Ruthenium drugs are very promising candidates for novel cancer therapy, with two drugs already in clinical trials, NAMI-A and KP1019 [31,32,18]. Thus, there is growing interest in the use of new organometallics for the treatment of various cancers and the development of safer and more effective therapeutic agents [26,5]. In the present work, we studied the cytotoxic activity of cistetraammine(oxalato)ruthenium(III) dithionate cytotoxicity towards human erythroleukemia (K562) tumor cell line. The antiproliferative activity of cis-tetraammine(oxalato)ruthenium(III) dithionate, a ruthenium-based complex, have been evaluated in vitro against human leukemia (K562) cells using trypan blue and MTT assay. Inhibition of cell proliferation is an important potency indicator for chemotherapeutic drugs. As shown in Figures 2 and 3 a and b, the tested compound induces cell death in a dose and time dependent manner on K562 cells. It is found that the effect was improved linearly while prolonging the incubation time. The determined IC50 values of this complex, 18.28 µM (Figure 3a), is considerably the same of those of the commercially used antineoplastic drugs cisplatin (IC50 = 11 µM) and oxaliplatin (IC50 = 18 µM) on the same tumor cell line [10]. These results corroborate previous observations that Ruthenium(III) complexes induces cytotoxicity towards tumor cells such as human Jurkat, HeLa and SK-BR-3, and murine S-180 and A-20 tumor cell lines [19, 5]. For ruthenium(II) complexes as methylimidazole (RMC1) we also found having cytotoxicity of 17.34 mg mL-1 for A549, 18.89 mg mL-1 for A375 and 20.25 mg mL-1 for Hep G2, respectively. The same compound exhibits cytotoxicity of 51.59 mg mL -1 for HBE (basal lineage), as well as demonstrating that the compound RMC1 ruthenium II [33]. The complex [Ru(phen)2(ƥ-MOPIP)]2+ can effectively inhibit proliferation of the A375 cell line with a low IC50 (5.9±1.1 mM). [Ru(bpy)2(dppn)]2+ exhibits high cytotoxicity against human HT-29 and MCF-7 cancer cell lines comparable to that of cisplatin induces cell death in a dose and time dependent manner [34], and [Ru(dmp)2(DBHIP)]2+ can effectively induce apoptosis of the BEL7402 cell line [35]. 83 The lower general toxicity of ruthenium compounds compared to platinum drugs has been attributed to the ability of ruthenium compounds to specifically accumulate in cancer tissues. The higher specificity of these compounds for their targets may also be linked to their selective uptake by the tumor compared with healthy tissue and to selective activation by reduction to cytotoxic species within the tumor [36,20,14]. Ruthenium-chloro complexes tend to undergo hydrolysis in aqueous media leading to the generation of cationic Ru–OH2 complexes capable of reacting with DNA with greater ease than the corresponding chloro complexes [37,38,39]. The hydrolyzed complexes interact with the N7 of guanine in DNA duplexes leading to disruption of the structure of genetic material [40]. To explore the mechanisms of the cytotoxic effects produced by cistetraammine(oxalato)Ruthenium(III) dithionate, drug-induced changes in cell cycle distribution were examined. Compared to the cell cycle profiles of untreated cells, flow cytometric analysis indicated the sub-G1 arresting effect of ruthenium compound on K562 cells, as ruthenium(III) dithionate already induced a 48.2% increase in the number of sub-G0/G1 cells after a 48h incubation. The ruthenium(III) compound caused a minor S phase accumulation after incubation at concentrations of 40 and 150 µM for all periods of exposition Figure 5. Treatment with 40 µM of cis- [Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) induced respectively a 1.7-fold, 2.2-fold and 2.4-fold increase in the number of sub-G0/G1 cells when compared to control for 24, 48 and 72 h, respectively Table 1. Furthermore, another important biochemical sign of apoptosis was studied: DNA laddering and fragmentation (data not shown), possibly representing DNA cleavage into oligonucleosomal fragments through activation of the cysteine protease caspase-3, which is involved in the proteolytic cleavage of key downstream proteins such as poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) [41,42]. This process ultimately results in DNA fragmentation and apoptotic death [41]. Although this type of binding has been suggested to mimic, to some extent, cisplatin-induced DNA crosslinking, other types of damage may exist that dominate or contribute to the biological activity of this drug prototype. Several studies have been using this test to corroborate the results obtained in other assays. In the present study, results derived from DNA laddering assay did not show K562 DNA fragmentation, instead the results shows DNA integrity and even 84 differences on DNA content. Is important note that this data does not corroborate with more sensitive techniques such as flow cytometry and comet assay, used in this work. These techniques confirmed that the ruthenium(III) compound interfere on cell cycle and induces cells to enter apoptosis. Thus, we can infer that the technique of DNA gel electrophoresis is not best assay to assess the degradation of genome DNA. The present study also evaluated the DNA-damaging effects detected by the alkaline version of the comet assay in K562 cancer cells. This assay has been used as a test to predict the risk to develop certain diseases (renal cell carcinoma, cancers of the bladder, esophagus, and lung) due to susceptibility of the individual to DNA damage [23]. The in vitro comet assay is proposed as an alternative to cytogenetic assays in early genotoxicity/photogenotoxicity screening of drug candidates as well as for neurotoxicity [43]. The alkaline comet assay has been used to assess the genotoxicity of chemicals, environmental exposures to carcinogens, toxins, and physical agents both in vitro and in vivo [44,45]. This method was also used to measure DNA repair capacity in live cells [46] and acellular systems [47]. In our study, cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) shows a significant increase in tailed cells in any of the concentrations tested compared with negative control ( Figure 4). Consequently, the concentration of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) might be associated cytotoxicity with direct effect on K562 cells DNA. Thus, it can be deducted that ruthenium-based compounds present selectivity to enter both tumor and normal cells. It is known that all the body cells present transferrin receptors, particularly tumor cells, in which these receptors are found in higher numbers. Due to these features, higher quantities of ruthenium complexes penetrate tumor tissue, reduce ruthenium(III) to ruthenium(II) and binding to DNA (guanine), and promote strand breaks [42,48,49,50,51,52]. Another hypothesis is that even in small quantities this compound might enter normal cells, because ruthenium(III) complexes are activated only by its reduction when it finds an environment with high concentration of glutathione, low pH, and occurrence of hypoxia. It is very common to find tumor cells presenting these conditions since it is known that these cells have high levels of glutathione and oxygen consumption when the nutrients are quickly used due to their accelerated development promoting hypoxia [49]. Consequently, these cells need more glycolitic energy, which increases the level of lactic acid in the tissues and 85 causes a decrease in the media pH. It is worth emphasizing that ruthenium(III) compounds can be used as pro-drugs that are activated by in vivo reduction to ruthenium(II) [52,49]. Broadening the chemotherapeutic arsenal depends on understanding existing agents with a view toward developing new modes of attack. Indeed, few of the organometallics compounds may function in a manner analogous to cisplatin, which appears to bend DNA by cross-linking adjacent guanines, thereby causing a class of DNA binding proteins to adhere to the site. Overall, the broad class of ruthenium(III) antitumor agents appears to differ from cisplatin by favoring interstrand rather than intrastrand cross-links [53]. In agreement with this hypothesis, it was demonstrated that NAMI-A induced apoptosis in the ECV304 transformed human endothelial and KP1019 in colorectal carcinoma cell lines via activation of caspase-3 and DNA fragmentation [41,54,55]. Despite the resounding success of cisplatin and closely related platinum antitumor agents, the movement of other transition-metal antitumor agents toward the clinic has been exceptionally slow [53]. Non-Platinum chemotherapeutic metallopharmaceuticals hold much promise for the future, and needs to be actively explored in a large variety of tumor types in combination therapies. Besides the already well established NAMI-A and KP-1019 activities on gastrointestinal, breast, prostate, and ovarian cancers [56,57,58] the present results indicate that cis[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) is worthy of further development as a potential anti-tumor drug that could be used in the treatment of leukemia. Thus, additional studies are needed to determine the molecular mechanisms of the active components and to evaluate the potential in vivo anticancer activity of the cis- tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) dithionate. 4. Material and methods 4.1. Synthesis of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) The cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) complex (Figure 1), was synthesized at the Universidade Federal de Uberlândia (UFU, Minas Gerais, Brazil) following a standard protocol described by Pereira et al [21]. The compound was characterized by electronic spectra at room temperature with the HP 8453 spectrophotometer with diodes arrangement, interfacing a compatible PC HP Vectra XM, using quartz cells. 86 Carbon and hydrogen microanalyses were performed by the staff of the Analitical Centre of the Chemistry Institute of Universidade de São Paulo (USP, São Paulo, Brazil). Figure 1. Chemical structure of cis-tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate. 4.2. Cell culture. The human erythroleukemia (K562) cell line (ATCC number CCL-243TM) was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). The cells were cultured in RPMI 1640 medium (pH 7.2-7.4) supplemented with 100U mL-1 penicillin G, 100g mL-1 streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1.5 g L-1 sodium bicarbonate, 4.5 g L-1 glucose, 10 mM HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate and 10% fetal calf serum (FCS) (all reagents were obtained from Gibco, Grand Island, NY, USA) at 37°C, 5% CO2 and humidified atmosphere. The cells were disposed into 96 well plates (1×105 cells/well) and cultured in RPMI 1640 medium. Cells were harvested at specified intervals and the number of cells per well was determined by cell counting with a hemocytometer (Neubauer chamber). Briefly, tumor cells were aspirated, washed in sterile PBS and an aliquot of the cell suspension was put in Trypan Blue 1% (m/v) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and counted. Only cell dilutions with > 95% of viable cells were included in the posteriors analysis. 4.3. Cell Citotoxicity (Trypan blue staining) The citotoxicity of the K562 cells was evaluated by the trypan blue exclusion assay. The tumor cells were incubated for 24 h, 48 h and 72 h with different concentrations of the tested ruthenium compound cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 87 0.015 – 32 µM) at 37 °C. Additionally, Carboplatin (50 µM) and Paclitaxel (25 µM) were applied as positive control. After incubation, the cells were washed in PBS (pH 7.4) and suspended in a complete RPMI 1640 medium. Then 40 µL of the trypan blue solution (0.4%, Sigma) and 10 µL of the cell suspension were mixed and after 5 min the percentage of viable K562 cells was evaluated under brightfield optical microscope using a newbauer chamber. The correlation between the viable cells (that excluded trypan blue dye) and dead cells (stained cells) were assessed. The results are presented as mean±S.D. (standard deviation) from three independent experiments. 4.4. Viability assay. Cytotoxic activity of cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) on K562 was measured by modified MTT assay [22], which is based on the reduction of yellow 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) to dark-blue, insoluble formazan in mitochondria of the living cells. The MTT assay was performed in 96-well tissue culture plates (Nalge-Nunc, Rochester, NY, USA) as follows: the cells (1 × 105/well) were seeded in tissue culture plates and incubated with the different concentrations of ruthenium compound (from 0.15 – 150 µM) dissolved in a total volume of 100 μL/well for 24 h and 48 h at 37 °C and 5% CO2. The cells incubated with medium only served as a control. Following the exposure to the tested substances, the cells were incubated with 10 μL of MTT solution (5 mg mL-1) (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA) for 3 h. The microplates were then centrifuged (300× g/15 min/10C) and the culture media were discarded. Afterwards 200 l of PBS/20% of SDS (lauryl sulfate) solution (Sigma-Aldrich, USA) was added to each well to stop the reaction and plates were kept in the dark overnight. After the next 12 h the absorbance of dissolved formazan was measured by a Stat Fax 2100 microplate reader (Awareness Technology, Palm City, FL, USA) at 565 nm. The cell viability was expressed in % related to control (100% of viability). The cytotoxic rate was calculated as follows: cytotoxicity (%) = [1 - (absorbance of the treated wells)/(absorbance of the control wells)]×100%. The cytotoxic effect of the tested substances was determined in at least three independent experiments, where each one of the culture plates contained the wells with tested concentration in triplicate, the wells with control (cells in medium) and the blank (culture medium alone). The 88 50% inhibitory concentration (IC50) value was determined using GraphPad Prism 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). 4.5. DNA laddering assay. Briefly, 2×106 cells (K562) were treated with different concentrations of cis[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 0.15 – 150 µM) for 24 h at 37 °C and 5% CO2. Cells were harvested and centrifuged at 300×g/15 min/10C and washed with PBS. The cells were then ressuspended at a concentration of 1×10 6 cells mL-1 in an extraction buffer (1 mol Tris-HCl, 2 mol Na2EDTA, 0,5g m L-1 SDS) and treated with 20 mg L-1 RNase A at 37°C for 60 min, followed by incubation with proteinase K (100 mg L-1) at 37°C for 60 min. An equal volume of saline solution (NaCl 6 M) was added to the cells and centrifuged at 13,000×g for 10min. The supernatant was collected and 2 volume ethanol (-20°C) were added. The samples were centrifuged at 13,000×g for 30 min at 4C. The supernatant was then discarded and the pellets dissolved in TE buffer (1×). The concentration of DNA was detected using a UV spectrophotometer (Beckman DU-640, USA). The DNA (5 µg/tube) was transferred to a 1.5% agarose horizontal gel, and electrophoresis was performed at 100V cm -1 for 90 min. The DNA in the gels was visualized by ultraviolet transillumination after staining with ethidium bromide (5 µg mL-1) using an Omega® molecular imaging system (UltraLum Inc., Claremont, CA, USA). 4.6. Comet Assay An aliquot of from each K562 culture was taken after 24 and 48 h incubation for the alkaline version of the comet assay [23]. The compound cis[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) was studied at different concentrations (from 10 – 150 µM). Briefly, 300 μL of the cell suspension was centrifuged for 5 min (500 rpm) in a refrigerated microcentrifuge (Sorvall Legend Mach 1.6 R, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). The resulting pellet was homogenized with 80 μL of a low melting point agarose (0.5%), spread onto microscope slides pre-coated with a normal melting point agarose (1.5%), and covered with a cover slip. After 5 min at 4°C, the cover slip was removed, and the slides were immersed in cold lysis solution 89 [2.4 M NaCl, 100 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), 10 mM Tris, 10% DMSO, and 1% Triton-X, pH 10] for 24 h. After lysis, the slides were placed in an electrophoresis chamber and covered with electrophoresis buffer (300 mM NaOH per 1 mM EDTA, pH>13) for a remaining 20 min to allow DNA unwinding. The electrophoresis proceeded for 20 min (25 V and 300 mA). Afterwards, the slides were submerged for 15 min in a neutralization buffer (0.4 M Tris– HCl, pH 7.5), dried at room temperature, and fixed in 100% ethanol for 5 min. All the steps were conducted in the dark to prevent additional DNA damage. Slide staining was performed immediately before analysis using ethidium bromide (20 μg mL−1). Slides were prepared in duplicate, and 100 cells were screened per sample (50 cells from each slide) in a fluorescent microscope (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany) equipped with an excitation filter of 515 –560 nm and a barrier filter of 590 nm using a ×40 objective. The nucleus was classified according to the migration of the fragments using the software CometScore 15 according to [20]. For damage index calculation, cells were sorted into four classes, according to tail size. The damage index (DI) is the sum of classes of the 100 cells analyzed per fish, and may vary from 0 (all cells undamaged – 0×100) to 400 (all cells highly damaged – 4×100). The damage index is based on the length of migration and on the amount of DNA in the tail, and it is considered a sensitive measurement of detectable DNA damage [21]. To quantify the damage to the DNA, the following formula was used: DI (au) = N1 + N2 + N3 + N4 S/100 where DI = DNA damage index, au = arbitrary unit, N1 - N4 = nucleoids in levels 1, 2, 3 and 4, S = number of nucleoids analyzed, including level 0. 4.7. Cell Cycle Analysis by flow cytometry In order to investigate the possible effect of the ruthenium compound on cell cycle progression, K562 cells were treated with different concentrations of cis[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) (from 1.5 – 150 µM) for 24, 28 and 72 h. Briefly, 5×105 cells were harvested by centrifugation, washed with PBS, fixed with 70% (v/v) cold aqueous ethanol and stored overnight at -20 ◦C. The fixed cells were washed with PBS and incubated with propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 90 containing 0.05% RNase. Samples were incubated at 4 ◦C in the dark and analyzed by flow cytometry (FACS CantoII, BD Biosciences, San José, CA, USA). The percentage of cells in G1, S, G2 and sub-G1 was analyzed using ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME, USA). 4.8. Statistical analysis. Three independent in vitro experiments were carried out. Statistical results were expressed as the mean ± standard deviation of the means obtained from triplicates of each independent experiment. Correlation tests were performed to determine the effects of concentration of ruthenium complex on tumor cell lines. Statistical significance of differences *(p0.05) as compared to untreated cells (control) was evaluated by applying analysis of variance (ANOVA) and Tukey or Dunnet’s post tests, when applicable. The IC50 (concentration that produces a 50% inhibitory effect on the evaluated parameter) was graphically obtained from the doseresponse curves. ACKNOWLEDGMENTS The authors gratefully acknowledge the financial support of Research and Projects Financing (FINEP) (Grant No.01.06.0941.00/CT-Saúde to Elisângela de Paula Silveira-Lacerda), Brazilian National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq) through fellowship to Flávia de Castro Pereira (Grant No. 131960/2008-3) and Coordination for the Advancement of Higher Education Staff (CAPES) through fellowship to Aliny Pereira de Lima and Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova-Costa. 91 REFERENCES [1] Canadian Cancer Society/National Cancer Institute of Canada: Canadian Cancer Statistics (2005), Toronto, Canada. ISSN: 0835-2976. [2] American Cancer Society: Cancer Facts & Figures (2009). http://www.cancer.org/acs/groups/content@epidemiologysurveilance/documents/doc uments/acspc-031941.pdf. [3] Robert, J. and Jarry, C. (2003). Multidrug resistance reversal agents. Journal of Medicinal Chemistry, 46, 4805–4817. 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LIMA2, ANGELICA ELLEN GRAMINHA2, ALZIR AZEVEDO BATISTA2, JAVIER ELLENA3, ELISÂNGELA DE PAULA SILVEIRA-LACERDA1 1Laboratory 1,2-bis (diphenylphosphino)ethane, or 1,1´- of Molecular Genetics and Cytogenetics, Institute of Biological Sciences, Federal University of Goiás - UFG, Goiânia, GO, Brazil 2Chemistry Department, Federal University of São Carlos – São Carlos, São Paulo, Brazil 3São Carlos Physics Institute, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil *Corresponding authors: Email, silveiralacerda@gmail.com; daab@ufscar.br Running title: Apoptotic activity of Ruthenium II in S180 cells 99 ABSTRACT Ruthenium complexes are considered to be a very promising approach to treating cancer, primarily because of their relatively low toxicity and high antitumor activity. Ruthenium exhibits the ability to mimic iron in its binding and transferring properties, and these are most likely the primary reasons for its low toxicity. This low toxicity could allow for the administration of a higher dose of a drug for a longer period to a patient, leading to a more efficient antineoplastic chemotherapy. Therefore, the motivation to use ruthenium complexes in cancer treatment has led our research group to synthesize new complexes with this metal and test them against different types of tumor cells, yielding promising results. In this paper, we will describe results involving biological studies that employed the [RuCl(bcn)(bipy)(dppb)]PF6, and [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6, [RuCl(bnc)(bipy)(dppf)]PF6 [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complexes. The present work studied the cytotoxic activity, apoptosis, changes in cell cycle and gene expression of a [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 treated sarcoma 180 (S180) tumor cell line. Ruthenium II complexes were tested in cell culture, cell viability testing with MTT, apoptotic cell analysis by flow cytometry, cell cycle analysis by flow cytometry, mitochondrial membrane potential (ΔΨm), Bcl-2 flow cytometry testing, caspase activity measurement, and real time quantitative PCR. The cytotoxicity of the complex was evaluated by MTT assay, and the mechanism of cell deaths induced by the complex was investigated. The results demonstrated that the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF 6 complex inhibits S180 cell growth with an IC50 value of 17.02 µM ± 8.21. The complex also exhibits higher cytotoxicity (53.73 μM ± 5.71) towards lymphocytes than normal cells. The flow cytometric analysis revealed that the complex inhibits the growth of tumor cells by inducing apoptosis, as evidenced by the increase in cells with positive annexin V and G0/G1 phase cell cycle arrest. Further investigation showed that the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe) complex induces a loss in the mitochondrial membrane potential, and the complex provokes decreased Bcl-2 protein expression and increased caspase 3 activation, but the increased activation of caspase 8 caused a decrease in caspase 3, 8, 9, Bax and p53 gene expression. In conclusion, the ruthenium [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex was promising against S180 tumor cells, and it may be a candidate for further investigation as a chemotherapeutic agent against sarcomas. 100 Keywords: Ruthenium complexes, Sarcoma 180 (S180), apoptosis induction, expression of pro-apoptotic genes 101 Introduction Chemotherapy based on transition metal compounds became promising after the discovery of cisplatin by Barnett Rosenberg [1 - 3]. Cisplatin is a chemotherapeutic that is used to treat carcinomas of the ovary, testis, bladder tumors, head and neck [3 - 5]. However, because of the high toxicity, tumor resistance and side effects of cisplatin and its derivatives, the search for a more effective and less toxic antitumor drug became necessary [1 - 3]. In this context, ruthenium complexes are considered a very promising approach, primarily because of their relatively low toxicity and high antitumor activity [4 - 7]. Ruthenium exhibits the ability to mimic iron in terms of its binding and transferring properties, and this is the most likely reason for its low toxicity. This low toxicity could allow for the administration of a higher dose of the drug for a longer period to the patient, leading to more efficient antineoplastic chemotherapy [8 – 12]. NAMI (ImH[trans-RuCl4(DMSO)(Im)]) and KP1019 (InH[trans-RuCl4In2]) [13, 14] have successfully completed phase II clinical trials for the treatment of metastatic tumors and colon cancers, respectively, but both have limitations as antitumor drugs [15]. Few studies have been performed on the anticancer activity of ruthenium (II) polypyridyl complexes [16, 18]. Therefore, the use of ruthenium complexes for cancer treatment has motivated our research group to synthesize new complexes with this metal and to test them against different types of tumor cells, yielding promising results. In this paper, we will describe a few results of biological studies that employed [RuCl(bcn)(bipy)(dppb)]PF6, and [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6, complexes. The [RuCl(bnc)(bipy)(dppf)]PF6 [RuCl(bCN)(bipy)(dppe)]PF6 diphosphines were chosen for their ability to stabilize Ru(II) complexes, and the diimines can assist in complex intercalation with DNA. A benzonitrile ligand was introduced into the complexes to make them anionic and more soluble in the cell culture medium. Material and Methods Chemicals All manipulations were performed under purified argon by standard Schlenk technique. Reagent grade solvents were appropriately distilled and dried before use. 102 All chemicals used in this work were purchased from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA. The cis-[RuCl2(dppb)(bipy)], cis-[RuCl2(dppf)(bipy)], and cis-[RuCl2(dppb)(phen)] starting complexes, in which dppb = 1,4-bis(diphenylphosphine)butane, dppf =1,10bis(diphenylphosphine)ferrocene, bipy = 2,20-bipyridine, and phen = 1,10- phenanthroline, were prepared according to methods from the literature [19]. The synthesis of the [RuCl(bcn)(bipy)(dppb)]PF6, [RuCl(bcn)(phen)(dppb)]PF6 and [RuCl(bnc)(bipy)(dppf)]PF6 complexes were published elsewhere [19]. Synthesis The synthesis of cis-[RuCl(bzCN)(P–P)(N–N)](PF6) complexes [N–N = 2,2`bipyridine (bipy) or 1,10-phenantroline (phen), P–P = 1,4-bis- (diphenylphosphino)butane (dppb) or 1,10-bis(diphenylphosphino)-ferrocene (dppf), and bzCN = benzonitrile] was performed as described in reference [19] by reacting with the corresponding cis-[RuCl2(P–P)(N–N)] precursor, which was dissolved in CH2Cl2 with three times the excess bzCN, but by using KPF6, instead of NH4PF6, in methanol under an argon atmosphere. The synthesis methodology for the [RuCl(bCN)(bipy)(dppe)]PF6 complex was similar, and cis-[RuCl2(dppe)(bipy)] was used as the precursor. In this case, the cis-[RuCl2(dppe)(bipy)] (72.66 mg; 0.100 mmol) was dissolved in CH2Cl2 (40 mL) with an excess of benzonitrile (21 μL, 0.200 mmol). The KPF6 (27.70 mg, 0.15 mmol) was dissolved in methanol (ca. 5 mL) and added to the ruthenium solution under an argon atmosphere for 24 h. The reaction volume was reduced to approximately 2 mL and ether (~15 mL) was added to precipitate the product, which was filtered off and washed with water (2 x 10 mL) and ether (2 x 5 mL). The yield was 90%. Crystals of the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6.0.75(C4H10O) species from the CH2Cl2/Et2O solution yielded suitable crystals for determining the X-ray structure, which is illustrated in Figure 1. Microanalysis for [RuCl(bCN)(bipy)(dppe)]PF6.2H2O: C% (calc) 52.98/52.96; H%, 4.53/4,23; N%, 4.19/4.30 Hydrogen NMR data for the [RuCl(bCN)(bipy)(dppe)]PF6 complex: 1H (400 MHz, 103 (CD3)2CO): δ 9.40 ppm (1H, m; bipy); 8.63 ppm (1H, d, J = 8.4 Hz; bipy); 8.49 ppm (2 H, t, J = 9.2 Hz; Ph); 8.36 – 8.28 ppm (2 H, m; bipy); 8.25 – 8.18 ppm (2 H, m; Ph); 7.86 ppm (1 H, t, J = 6.4 Hz; bipy); 7.81 – 7.71 ppm (1 H, bipy; 3 H, Ph, m); 7.65 ppm (1H, t, J = 8.0 Hz; bCN); 7.50 – 7.37 ppm (8 H, m, Ph); 7.31 ppm (2 H, dt, J = 8.0 e 2.4 Hz, bCN); 7.20 ppm (1 H, m, bipy); 7.12 ppm (1 H, m, bipy); 7.01 – 6.92 ppm (2 H, bCN; 2 H, Ph, m); 6.82 – 6.75 ppm (2 H, t, J = 8.8; Ph); 6.68 – 6.62 ppm (1 H, m; Ph); 3.70 – 3.44 ppm (2 H, m, CH2); 3.14 – 2.98 ppm (1 H, m, CH2); and 2.95 – 2.79 ppm (1 H, m, CH2). Apparatus The 31P{1H} NMR experiments were recorded on a BRUKER 9.4 T instrument (400 MHz for hydrogen frequency) in CH2Cl2 by using a capillary containing D2O. The microanalyses were performed in the Microanalytical Laboratory of the Department of Chemistry at the Universidade Federal de São Carlos, São Carlos (SP) by using a FISIONS CHNS, mod. EA 1108 microanalyses. X-ray crystallography The crystals of the isolated complexes were grown by the slow evaporation of dichloromethane/diethyl ether solution. These crystals were mounted on an EnrafNonius Kappa-CCD diffractometer with graphite monochromated Mo-Ka (k = 0.71073 Å) radiation. The final unit cell parameters were based on all the reflections. Data collections were taken by using the COLLECT program. The integration and scaling of the reflections were performed with the HKL Denzo-Scalepack system of programs. Gaussian absorption corrections were performed. The structures were solved by direct methods with SHELXS-97. All hydrogen atoms were stereochemically positioned and refined with the riding model. The ORTEPs shown in Figure 1 were prepared by using ORTEP-3 for Windows. The data collections and some experimental details are summarized in Table 2. 104 Table 2: Crystallographic data for the [RuCl(bzCN)(bipy)(dppe)]PF6 complex. 1.1.1. [RuCl(bCN)(bipy)(dppe)]PF6 Empirical formula Formula weight Temperature / Wavelength Crystal system Space group Unit cell dimensions [RuC43H37N3P2Cl]PF6.0.75(C4H10O) 994.78 293(2) K / 0.71073 Å Monoclinic P21/c a = 16.4610(2) Å b = 17.5844(5) Å, β = 98.408(1)°. c = 16.5738(2) Å 4664.41(10) Å3 / 4 1.417 Mg/m3 0.557 mm-1 2030 0.26 x 0.38 x 0.15 mm3 3.02 to 25.68°. -20h  20, -20k 21, -19l 20 32036 8831 [R(int) = 0.0534] 99.6 % 0.939 and 0.819 8831 / 1 / 559 1.038 R1 = 0.0493, wR2 = 0.1391 R1 = 0.0671, wR2 = 0.1511 0.639 and -0.563 e.Å-3 Volume / Z Density (calculated) Absorption coefficient F(000) Crystal size Theta range for data collection Index ranges Reflections collected Independent reflections Completeness to theta = 25.35° Max. and min. transmission Data / restraints / parameters Goodness-of-fit on F2 Final R indices [I>2σ(I)] R indices (all data) Largest diff. peak and hole Cell Culture S180 (mouse sarcoma S180), DU145 (prostate cancer), K562 (chronic myeloid leukemia) and A549 (lung cancer) cells were obtained from the Rio de Janeiro Cell Bank/RJ, Brazil. The cells were cultured in RPMI1640/DMEM medium (pH 7.2-7.4) supplemented with 100 µm L-1 penicillin G, 100 μg mL−1 streptomycin, 2 mM L-glutamine, 1.5 g L-1 sodium bicarbonate, 10 mM HEPES and 10% fetal calf serum, 1% (w/v) (all reagents were obtained from Gibco, Grand Island, NY) at 37°C under a 5% CO2, humidified atmosphere. The human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were collected from healthy volunteers aged 20-30 years with no history of smoking, drinking, or chronic drug use. The PBMCs were isolated by density centrifugation of heparinized blood on Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norway), washed three times with Hank’s balanced salt solution (Sigma Chemical, 105 St. Louis, MO, USA), counted, suspended in RPMI 1640 medium (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco), and incubated (37°C, 5% CO2) for 24 h before drug treatment [52]. The protocol (043/2007) for these experiments was approved by the Ethics Committee of the Universidade Federal de Goiás and, prior to joining the study, all blood donors signed an informed consent form. Cytotoxicity assays The effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)](PF6), RuCl(bnc)(phen)(dppb)(PF6), RuCl(bnc)(bipy)(dppb)(PF6) and [RuCl(bnc)(bipy)(dppf)]PF6 on the viability of S180, DU145, K562, A549 and lymphocyte cells were studied by MTT assay as described previously [20]. In brief, 1×105 S180, D145, K562, A549 and lymphocyte cells were plated in 96-well tissue culture plates and treated with different concentrations of the ruthenium (II) complex (0.2, 2, 20, 50, 100 and 200 µM) for 48 h. After treatment, 10 µL of MTT (5 mg mL-1) was added to each well, and the plates were incubated at 37°C for another 3 h. The purple formazan crystals were dissolved in 50 µL of SDS, and the absorbance was determined at 565 nm by using a Stat Fax 2100 microplate reader (Awareness Technology, Palm City, FL, USA). The cell viability was calculated as follows: Viability (%) = (Absorbance of the treated wells)/(Absorbance of the control wells)×100. Each concentration was tested in three different experiments that were run in triplicate. The IC50 (the compound concentration (in µM) that produces a 50 % reduction in cellular viability) was obtained from the doseresponse curves by using GraphPad Prism 4.02 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). After screening the Ru complexes, the best compound was designated as the one that exhibited a value lower than the IC 50 for the tumor strains in relation to the healthy cell so that the other tests on the cellular death mechanism could be studied. The IC50 was determined by using the selectivity index (IS) for all ruthenium complexes (II) and cisplatin with the following formula: IS= IC50 non-tumor cell (PBMC)/IC50 tumor cell (EAT), and it was considered significant at IS ≥ 2.0 [22]. Analyzing the cell cycle by flow cytometry 106 The possible effect of the ruthenium compound on cell cycle progression was investigated after treating the S180 cells for 24 and 48 h with 24 μM of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6. In brief, 5×105 cells were harvested by centrifugation, washed with PBS, fixed with 70% (v/v) cold aqueous ethanol and stored overnight at -20°C. The fixed cells were washed with PBS and incubated with propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) containing 0.05% RNase. The samples were incubated at 4°C in the dark and analyzed by flow cytometry (FACSCalibur, BD Biosciences, San José, CA, USA). The percentage of cells in sub-G1, G0/G1, S, and G2/M was analyzed with ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME, USA) [53]. Detecting apoptosis by using the annexin V binding assay Apoptosis-mediated cell death and necrosis were distinguished by using double labeling assays. After treating with [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 for 24 and 48 h, 5×105 S180 cells were examined by using a FITC-labeled Annexin V/Propidium Iodide (PI) Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) according to the manufacturer’s instructions. The S180 cells were treated with [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 µM) for 24 and 48 h. In brief, 5 x 105 cells were harvested and washed with PBS. The cells were re-suspended in 400 µL binding buffer. Next, 5 µL of Annexin V-FITC and 3 µL of PI were added. Flow cytometric analysis was performed immediately after supravital staining. Data acquisition and analysis were performed in the flow cytometer (FACSCalibur, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) by using Cell Quest software. The positive criteria for cells in the early stages of apoptosis were Annexin V-positive and PI-negative, whereas the cells in the late stages of apoptosis were both Annexin V and PI-positive [54]. Evaluating mitochondrial membrane potential (∆Ψm) The dual emission dye, named JC-1, was used to measure the ∆Ψm according to the methods described previously [55]. In brief, 3 x 105 of S180 treated with [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 µM) were incubated with 2.5 mg mL-1 JC-1 (dissolved in DMSO) for 15 min. at a room temperature of 37°C in an incubator with 5% CO2 under darkness. After centrifugation for 5 min. at 200 × g, the cells were 107 washed twice with PBS at 4°C, re-suspended in 5 mL of PBS, and analyzed on a FACSCalibur flow cytometer. JC-1 is a lipophilic ionic fluorescence dye, and it is capable of selectively entering the mitochondria, which will change color from red (FL-2) to greenish (FL-1) once the ∆Ψm declines. The data were analyzed in Cell Quest, and these values represent the mean fluorescence intensity. Assaying caspase-3, 8 and 9 activity A direct measurement of the caspase 3, 8, and 9 activities were performed by using an ApoTarget Caspase-3, 8, and 9 Protease Assay (Invitrogen) according to the manufacturer’s recommendations. After treating with [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 M) for 24 h, the cells were lysed with chilled cell lysis buffer. The protein concentration was then measured by using the BSA Protein Assay Kit (BioRad). An aliquot of the protein extract (75 µg) was mixed with 50 µL of 2X reaction buffer supplemented with 10 mM DTT and the substrates of DEVD-pNA (caspase-3), IETDpNA (caspase-8), or LEHD-pNA (caspase-9). The mixtures were then incubated for 2 h at 37°C. The formation of p-nitroanilide in the samples was subsequently measured by using an ELISA microplate reader at 405 nm. The increased activities of caspase3, caspase-8, and caspase-9 were determined by comparing the results with the control. Analyzing Bcl-2 by flow cytometry After treating the S180 cells with the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex for 24 h with concentrations of 24 and 48 µM, the cells were taken from the culture and transferred to a flow cytometry tube, and they were centrifuged at 1800 rpm for 3 s. The supernatant was discarded, and the cells were washed with 1X PBS and centrifuged again. After discarding the supernatant again, the cells were resuspended in 500 µL of lyses buffer for 10' at room temperature (20° to 30°C). After this time, the cells were centrifuged one more time and the supernatant was removed. 500 µL of permeabilization solution was then added for 10', the cells were centrifuged again and the supernatant discarded. The cells were then washed with BSA buffer (1X PBS, 0.5% SFB and 0.1% sodium azide). The cells were centrifuged 108 after washing and the supernatant was discarded. 20 µL of the Bcl-2 reagent was added. The tube was mixed and incubated for 30´ at room temperature (20° to 30°C). The cells were centrifuged and the supernatant was discarded after the incubation, and the cells were washed again with BSA. Afterwards, the same cells were resuspended in 500 µL of BSA and analyzed immediately. Total RNA extraction and cDNA synthesis The S180 cells were treated with 24 μM [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 for 3, 6 and 12 h. Total RNA was extracted with Trizol reagent (Sigma-Aldrich, USA) by following the manufacturer’s protocol. Total RNA (2.0 μg) was used to produ ce complementary DNA (cDNA) with random primers (Applied Biosystems, USA) in a 20 μL reaction mixture according to the manufacturer’s protocol. Real-time quantitative PCR Real-time PCR was performed in a Line Gene K (Bioer Technology) instrument. Real-time PCR reactions were performed in a 20 μL reaction mixture, including 2 μL of cDNA, 10 μL of SYBR Green PCR Master Mix (LGC Biotechnology, UK), and 2.0 μL of 400 nM forward and reverse primers. The PCR program was initiated at 95°C for 15 min followed by 40 cycles of 95°C for 15 s, 55°C for 15 s, and 72°C for 30 s. The data were analyzed according to the comparative Ct method, and they were normalized to the β-actin reference gene expression in each sample. The primer sequences are shown in Table 3. Table 3: Primer sequences used for the real time RT-PCR assay. Gene β-actin bax caspase 3 caspase 8 Primer sequences F5’CACACCCGCCACCAGTTC3’ R5’ATTCCCACCATCACACCCTG3’(161 bp) F5’GCTACAGGGTTTCATCCAGG3’ R5’GGAGACACTCGCTCAGCTTC3’(113 bp) F5’GGAGCTTGGAACGCTAAGAA3’ R5’GTCCACTGACTTGCTCCCAT3’ (112 bp) F5’AGGTACTCGGCCACAGGTTA3’ R5’TGGGATGTAGTCCAAGCACA3’(137 bp) 109 caspase 9 p53 F5’TAGCTGGAACACTGGGCATTGAGT3’ R5’AACATACCCATCGGTGCATTTGGC3’(146pb) F5'TGGAAGACTCCAGTGGGAAC-3' R5'TCTTCTGTACGGCGGTCTCT-3'(87pb) Statistical Analysis A statistical analysis of the results was performed by one-way ANOVA and Tukey’s or Dunnett’s post-test for multiple comparisons with a control. All statistical analyses were performed with the statistical software GraphPad Prism, version 4. A probability of 0.05 or less was deemed statistically significant. The following notation was used throughout the analysis: *p<0.05 and **p<0.01, relative to the control. Results and discussion The X-ray structure of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6.0.75(C4H10O) is illustrated in Figure 1. Figure 1 - ORTEP illustrates the [RuCl(bzCN)(bipy)(dppe)]PF6.0.75C4H10O complex, showing the atom labels and the 50% probability of ellipsoids. This figure also shows the selected bond lengths (Å) and angles (o) for the [RuCl(bzCN)(bipy)(dppe)]PF6 complex, with estimated standard deviations in parentheses as follows: Ru–P1 (trans Cl)= 2.2775(9); Ru–P = 2.3096(10); Ru–N3 (trans P2)= 2.128(3); Ru–N2 = 2.079(3); Ru–Cl= 2.4336(10); Ru–N1 = 2.022(3); N1-C1 = 1.140(5); O(1)-C(19) = 1.239(17); O(1)-C(20) = 1.360(15); P–Ru–P = 84.84(3); and Cl–Ru–N≡C = 86.40(9). 110 The X-ray structures of the [RuCl(bzCN)(dppb)(phen)]PF6 and [RuCl(bzCN)(dppf)(bipy)]Cl complexes were previously published [19], and their bond lengths and angles are similar to those reported here for the [RuCl(bzCN)(bipy)(dppe)]PF6 complex. For all four complexes studied in this work, the benzonitrile ligand was trans to the nitrogen from the diimine [19]. The bond lengths of Ru-N for the nitrogen were trans to the phosphorus atoms in all four complexes, and they were also longer than the distance for the nitrogen trans to the cyan group as a consequence of the high trans effect of the phosphorus atoms. The 31P{1H} RMN of the complexes presents two doublets, that is, δ 66.2 and P-P 58.4 ppm, and 2J = 17.8 (Hz) in CH2Cl2(D2O) solution, showing that the phosphorus atoms are magnetically different, as expected from its X-ray structure. Cytotoxicity assay The cytotoxicity of complexes [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6, and RuCl(bnc)(phen)(dppb)(PF6), RuCl(bnc)(bipy)(dppb)(PF6) [RuCl(bnc)(bipy)(dppf)]PF6 to different cell lines such as S180 (mouse sarcoma S180), DU145 (prostate cancer), human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), K562 (chronic myeloid leukemia) and A549 (cancer lung) was assayed by observing the cell survival after 48 h of exposure to the desired concentration range (0,2 - 200 μM) of MTT [20]. The resulting IC50 values are listed in Table 3. These compounds show different phosphines that are coordinated with the ruthenium element, and the results indicated a significant increase in their activity [21]. The following IC50 values were found for the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 and RuCl(bnc)(bipy)(dppf)(PF6) complexes: PBMC 53.73 ± 5.71 and 51.14 µM, respectively. It is interesting to note that the IC50 values for PBMC are considerably higher than they are for S180 and A549 with their IC50 values of 17.02 µM ± 8.21 and 38.26 µM ± 0.79 µM, respectively. For the K562 and DU145 IC 50 strains, the IC50 values were 11.6 ± 5.74 and 16.7 ± 1:22, respectively, for the [RuCl (BCN) (bipy) (dppe)] PF6 complex. For the [RuCl (BNC) (bipy) (dppf)] PF6 complex, the IC50 was 10.17 ± 1.1 for K562 and 10:01 ± 8.83 for DU145. The IC50 of the [RuCl (BNC) (phen) (dppb)] PF6 complex for S180, DU145, K562, A549 and PBMC was 8.89 ± 3.93, 4.18 ± 0:34, 4:42 ± 0.88, 20.87 ± 12:13 and 17:24, respectively. For the [RuCl (BNC) (bipy) (dppb)] PF6, the IC50 values for S180, DU145, K562, A549 and PBMC 111 complexes were 13.85 ± 4.19, 1.83 ± 1.01, 9.79, 0.73 and 10.5 ± 20:37, respectively. These complexes were selective, and they were more cytotoxic in tumor cell lines such as S180 and showed high resistance to current treatments. Thus, the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex was evaluated as its possible mechanism of cell death in S180 tumor cells. The selectivity index (SI) indicates the selectivity of the studied complexes and their potential use for in vivo preclinical and clinical testing. IS values ≥ 2 are considered significant according to table 1. The [RuCl (BCN) (bipy) (dppe)] PF6 complex has a good selectivity index that is equal to 3 for S180 [22]. Table 1 – The IC50 (µM) values of ruthenium II complexes against the selected cell lines. Data show means ± SD of three independent experiments. IC50 (µM) Ruthenium Complexes S180 DU145 K562 A549 PBMC S1 80 DU1 45 IS K56 2 A54 9 [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 [RuCl(bnc)(phen)(dppb)]PF 6 17.02±8.21 7.16±1.22 11.6±5.74 4.42 20 53.73±5.71 3 8 5 3 8.89 ± 3.93 13.85±4.19 4.18 ±0.34 1.83 ±1.01 ±0.88 9.79 20.87 ±0.13 20.37 ±0.73 17.24 10.5 2 1 4 6 4 1 1 1 [RuCl(bnc)(bipy)(dppb)]PF6 [RuCl(bnc)(bipy)(dppf)]PF6 14.94 ± 3.1 10.01±8.83 10.17±1.1 38.26 ± 0.79 51.14 3 5 5 1 Analyzing the cell cycle by flow cytometry The cell cycle distribution of S180 cells that were treated with the near-IC50 value of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 µM) was examined by flow cytometry. The effect of the ruthenium complex [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 on the S180 cell cycle was evident in the cells that were investigated by flow cytometry. In Fig. 2, there are histograms indicating the DNA quantity distribution. After 24 h of exposing S180 cells to [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 µM), we noticed an increase in the G0/G1 phase from 22% to 50% in relation to the negative control (p<0,001) and there was a decrease in the S phase of 25%. The cell cycle distribution at 48 h showed a timedependent and discrete increase in the sub-G1 (12%) peak, but it was not statistically 112 significant (p<0,01). There was also an increase of 35% in the G2/M phase (Figure 2). Figure 2 - The cell cycle status of the S180 cells after treating with [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 µM) complex for 24 and 48 h (Graphical A and B). C - A histogram of the PI fluorescence (x-axis) versus counts (y-axis) is shown (G0/G1, S, and G2/M). Data were analyzed with ModFit software (Becton Dickinson, San José, CA, USA). Data show the means±SD of three experiments. Significant differences from the untreated control are indicated by **p<0.01 and ***p<0.001. 113 Detecting apoptosis by using the Annexin V binding assay Apoptosis is a tightly regulated physiological process that is characterized by a series of biochemical events and ultrastructural alterations (e.g., the activation of caspases, phosphatidylserine externalization, membrane blebbing, cell shrinkage, nuclear fragmentation, chromatin condensation, and chromosomal DNA fragmentation) [23]. In apoptotic cells, phosphatidylserine is translocated from the inner to the outer leaflet of the plasma membrane, where it can be detected by its binding to intracellular protein annexin V, which is labeled with a fluorophore [24]. The annexin V assay is able to distinguish apoptotic cells from viable or necrotic cells on the basis of the resulting fluorescence of the former cells. A simultaneous dead cell stain employs the fluorochrome propidium iodide (PI), which can only penetrate dead cells that have lost or are losing membrane integrity. PI intercalates into DNA to produce a highly fluorescent adduct, which is indicative of late apoptosis or necrosis [25]. The objective of this work was to investigate if [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF 6 could induce apoptosis or necrosis in S180 cells, using annexin V-FITC/propidium iodine staining. As shown in Figure 3 A and B, after treating with 24 μM of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 for 24 and 48 h, the S180 cells in initial apoptosis (annexin V + and PI-) represented 2.89% (24 h) and 5.06% (48 h) of the total cells, and the cells in late apoptosis (annexin V + and PI-) represented 32.56% (24 h) and 30.09% (48 h) (p<0,001) of the total cells, respectively. There are histograms showing the dot plot distribution in Figure 3 - C. The results showed the cytotoxic activity of the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex in S180 cells, possibly by its interaction with the DNA molecule, leading to cleavage by the apoptosis process. 114 C Figure 3 – Effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 on S180 cells. A and B - The harvested cells were stained and washed with phosphate-buffered saline, and apoptosis was assayed by using an annexin V-fluorescein isothiocyanate/PI assay kit in a double-labeling system for 24 and 48 h. C - The effect of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6-induced apoptosis on S180 cells. The harvested apoptotic cells (annexin V+/PI+) were analyzed by flow cytometry, and the dot plot displays the annexin V fluorescence (x-axis, logarithmic scale) versus PI fluorescence (y-axis, logarithmic scale). Data show the means±SD of three experiments. Significant differences from the untreated control are indicated by ***p<0.001. Mitochondrial potential – JC - 1 The mitochondria control the life and death of cells, thus deciding the destiny of a cell because they control the apoptosis process [26]. The different functions of the mitochondria are connected to the mitochondrial membrane potential, which is a 115 vital component of respiration [27]. Alterations in the mitochondrial membrane potential trigger apoptotic signs that are crucial to the activation of the inner and outer apoptotic paths [28]. The lowering in the mitochondrial membrane potential and the release of apoptotic factors are key elements that trigger the apoptotic process [28]. Studies show that many Ru(II) complexes can lead to a lowering in the mitochondrial membrane potential [29-31]. A JC-1 test was used to find if [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 leads to a lower mitochondrial membrane potential. JC-1 is a fluorescent dye, and it was used as an indicator of ∆Ψm alterations. JC-1 (lipophilic cationic dyestuff) easily crosses the plasmatic membrane of the cells and agglomerates in active mitochondria [32]. When there is a low ∆Ψm, the JC -1 begins to act as a monomer that emits green fluorescence. However, when there is a high ∆Ψm, the J-dye is fixed to the cells. Thus, these dye aggregates induce a change in green fluorescence emission to red fluorescence emission. This finding can be observed in the negative control of Figure 4 with a higher emission of red fluorescence (83%) in relation to the green fluorescence (17%), indicating the presence of mitochondrial activity. After treating cell line S180 with the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex for 24 h at a concentration of 24 µM, there was a low of 60% in the emission of red fluorescence in the negative control, and in the cells that were exposed to the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex, the green fluorescence emission was 40% (p<0.0001). These alterations from red to green fluorescence following exposure to the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex demonstrate a decrease in the mitochondrial membrane potential (∆Ψm), indicating that the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex induces apoptosis in cell line S180 through a mitochondrial pathway (Figure 4). 116 Figure 4- Effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 in S180 cells; the ΔΨm was determined by using JC-1 (5,5c,6,6c-tetrachloro-1,1c,3,3c-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide). A Flow cytometric analysis of cells stained with cell-permeable JC-1 dye revealed that [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 depolarized the mitochondrial membrane as indicated by decreases in the FL2-H fluorescence, as analyzed by JC-1 flow cytometry. The number in each dot plot represents the percentage of cells that lost ΔΨm. Each column represents the means ± SD (bars) of two experiments. *** p < 0.0001 compared with the control. Bcl-2 Analysis by flow cytometry After 24 h of exposure, a Bcl-2 antigen marked with FITC was used as an indicator for the increase or decrease of Bcl-2 protein expression in cell line S180. The Bcl-2 protein expression was altered after being exposed to the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 and 48 µM) complex for 24 h. In Figure 5, peak M2 indicates cells that have active Bcl-2, and M1 is the peak relative to the amount of cells that do not have active Bcl-2 protein. The negative control exhibited 5% of the Bcl-2 protein after 24 h in the S180 culture, after the same exposure time with the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex at 24 µM, a 2.5-time decrease that was observed for Bcl-2 protein expression when compared with the negative control and a decrease of 28.5 times when compared with the positive control. When the S180 cells were exposed to 48 µM of the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF 6 complex, there was a decrease of 5 times in the Bcl-2 protein when compared with the negative control and a decrease of 57 times when compared with the positive control (p<0.0001). These 117 results demonstrated that the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex provoked a decrease in the presence of the Bcl-2 protein (figure 5). Figure 5 – Effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 on the Bcl-2 protein of S180 cells after 24 h of exposure in concentration of 24 and 48 µM. Data show the means±SD of two experiments. Significant differences from the untreated control are indicated by **p<0.01 and***p<0.001. Colorimetric caspase test The effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (24 µM) on caspase-3, 8 and 9 activities were investigated in S180 cells after 24 h of treatment (Figure 6). As indicated by these results, the caspase 8 and 9 activities were not changed by [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 treated cells when compared with untreated control cells. However, the assessment of caspase-3 activity showed a significant enhancement in relation to the control after incubating the cells with [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 for 24 h with an increase of 5 fold relative to the negative control. The maximum enzymatic activity was observed at 24 h for caspase-3 at 450%. Thus, the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex induced caspase-3 activation, which confirms the triggering of the apoptotic process. The caspases play an important role in the signaling system and the apoptotic process. Caspases can control the apoptotic process intensity or inhibition [33]. A large activation of caspase-3 was observed in the present study as in many in vitro studies, showing that the Ru (II) complexes can activate the apoptotic pathway [34, 35]. 118 Figure 6 - Activation of caspase-3, -8 and -9 in S180 cells treated with 24 µM of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 for 24 h. Caspase activity was calculated as the fold induction of basal caspase-3, -8 and -9 activities in non-treated S180 samples. Each column represents the means±SD (bars) of two experiments. * p< 0.05 compared with the control. Real-time Quantitative PCR For a better understanding of the apoptosis induction mechanism provoked by the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex, the altered expression levels of the genes that were involved in the apoptotic process were investigated. The effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 on the messenger RNA (mRNA) expression of Bax, p53, caspase-3, caspase-8 and caspase-9 were analyzed by real-time quantitative PCR. The mRNA expression of Bax with 3 h of exposure to [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 was not significant when compared with the control, but it exhibited a slight increase. However, there was a significant increase (3.14-fold) after 6 h of exposure to [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 (Figure 7). Pro-apoptotic Bax/Bak are essential regulators of the mitochondrial or intrinsic pathway of apoptosis [36, 37]. In this intrinsic pathway, an increased level of Bax and/or a decreased level of Bcl-2 may permeabilize the mitochondria following DNA damage [37, 38]. Based on these factors, it can be inferred that the apoptosis induced by the Ru complex caused a lower Bcl-2 expression as observed in the flow cytometry test that led to the translocation of Bax in the mitochondrial membrane within a 6 hour period of exposure. The p53 expression was increased by 22-fold when treated with 24 µM of the compound after 3 hours of exposure, falling to less than 1-fold after 6 and 12 hours of exposure. There was no gene expression when the cells were treated with 48 µM with 3 hours of exposure, but after 6 hours there was a7-fold increase in gene 119 expression compared with the negative control. After 12 hours of exposure, there was no gene expression when compared with the negative control. Approximately 50% of human cancer exhibits alterations in the p53 gene, which is a tumoral suppressor; this gene is responsible for cell growth, for cell sensibility to irradiation, and for multiple chemotherapeutics [39-41]. A functional p53 can negatively regulate Bcl-2, protecting the cells from apoptosis and allowing the cells to survive through a variety of fatal cellular events [42]. The results obtained in this study show that the Ru complex increased the expression of p53 after 3 hours of exposure. This finding indicated a probable alteration in the DNA molecule that led to the translocation of the p53 in the cytoplasm to the S180 cell nucleus, thereby inducing the apoptosis process. The p53 is a key suppressor of tumor regulators in the apoptosis process and has pro-apoptotic activity. Under stressful conditions, p53 is stabilized and acts as a transcription factor that can increase the expression of target pro-apoptotic genes such as Puma, Noxa, Bax and Bid [43]. Cytoplasmic p53 interacts with the members of the Bcl-2 and Bcl-xL family, which leads to the activation and translocation of Bax and Bid in the external mitochondrial membrane. There was also an observable increase in the Bax expression. In addition, the p53 is also translocated to the mitochondria, activating apoptosis by the mitochondria [43-45]. The apoptosis induced by the Ru complex was observed through the increased Bax expression, p53 and caspase 8. The mRNA expression of caspase 8 was 2-fold higher (compared with the negative control) for 3 h after exposure to the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 compound. Caspase-8 expression was not significant after 6 and 12 h of compound exposure. Caspase-9 was not significant at any exposure time. This increased expression was retained after 6 hours of exposure to the compound. The mRNA expression of caspase-3 was not significant after 6 and 12 h of exposure. Many chemotherapeutics have been shown to induce the apoptosis process in tumor cells [46-48]. These results suggest that [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 may be capable of inducing the expression of genes involved in the apoptosis process; this particular conclusion was observed because the compound induces the synthesis of the p53 gene, which acts in a pro-apoptotic manner [49]. These results are similar to those of other areno-organometallic cycloruthenated compounds found in the literature [50]. The evidence suggests that chemotherapeutics induce cell death by 120 apoptosis after treating with these chemotherapeutics, thus showing that this is an important mechanism of cytotoxic action by these complexes [51]. This characteristic can be observed primarily with the [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex, which significantly increased the expression of pro-apoptotic genes such as Bax. Figure 7 – Effects of [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 on the mRNA expression of caspases 3, 8 and 9; Bax and p53 were evaluated by real-time quantitative PCR. Data show the means±SD of experiments performed in triplicate. Significant differences from the untreated control are indicated by ***p<0.001. Conclusions The Ru (II) complexes exerted antiproliferative effects over the tested S180 tumor cells. The complexes seem to be effective at inhibiting cell growth, inducing alterations in the G0/G1 and S phases in addition to inducing the apoptosis that was observed in both the annexin and JC-1 trials. Our data suggest that the Ru (II) complexes tested in this work most likely trigger the apoptosis process through an intrinsic pathway, showing that these complexes interfere in DNA replication most likely by interacting with the DNA. Furthermore, the results demonstrated the gene expression involved in the apoptosis process. These results suggest that the Ru complexes tested here are future chemotherapeutic candidates for cancer treatment. Highlights  Ru (II) compound [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 increases the expression of caspase-3 5-fold, leading to cell death. 121  The JC-1 test demonstrated that [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 triggers apoptosis, most likely through the mitochondrial pathway.  The increased expression of caspase 8, p53 and Bax provoked by the Ru (II) [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6 complex demonstrates the possible activation of extrinsic and intrinsic apoptosis pathways. Scheme 1 - A schematic illustration of Ru II activating the intrinsic and extrinsic passage of the carcinogen cell. This scheme illustrates the increased level of caspase 8 expression (originator) in addition to the increased level of protein caspase 3 (effector) triggered by the intrinsic passage and most likely also by extrinsic passage. With Ru II exposure, an alteration in the mitochondrial membrane was observed in response to the large increase in Bax expression, which led the mitochondria to liberate apoptotic factors and activate caspase 3, which amplified the cell death signal. 122 References [1] Rosenberg B, Van Camp L, Trosko JE, and Mansour VH. (1969) Platinum compounds: a new class of potent antitumour agents. Nature 222: 385 –386. [2] Reedijk J. (1996) Improved understanding in platinum antitumour chemistry Chem. Commun. 801-806. [3] Devi CS, Kumar DA, Singh SS, Gabra N, Deepika N, et al. 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Artigo 2  O complexo de rutênio (II) induziu citotoxicidade sobre a linhagem tumoral S180 apresentando valor de IC50 de 17,02±8,21µM e menor atividade citotóxica sobre linhagem normal de linfócitos, apresentando valor de IC50 de 53,02 µM, valor este superior ao verificados para a linhagem tumoral;  O complexo Ru (II) alterou a cinética do ciclo celular da linhagem tumoral S180 visto que aumentou a porcentagem de células na fase G0/G1 com consequente diminuição da fase S, indicando que este complexo pode ser classificado como um agente ciclo celular específico;  O complexo Ru (II) induziu morte celular via apoptose como evidenciado pelo aumentou de células Anexina V positiva;  A apoptose induzida pelo complexo Ru (II) em células S180 envolveu o aumento da atividade de Casp3 e 8 demonstrando assim a participação de ambas as vias intrínseca e extrínsica no mecanismo de indução de apoptose induzida pelo complexo Ru (II);  O complexo de Ru (II) provocou a diminuição da proteína Bcl-2 intracelular;  Os mecanismos envolvidos no processo de apoptose após tratamento com 130 Ru (II) foram também demonstrados pela despolarização do potencial de membrana mitocondrial, aumento da expressão dos genes pró-apotóticos Bax e Casp3, alterando também a expressão de Tp53. 131 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS Pesquisas para o desenvolvimento de novos fármacos contra o câncer têm levado a grandes e extensas investigações com complexos de rutênio. Os complexos de rutênio tornaram-se atraentes principalmente porque eles apresentam três propriedades importantes e adequadas para aplicações bilogicas: 1 – esses metais tem a cinética de troca de ligantes semelhantes aos complexos de platina II, 2 – tem difirentes estados de oxidação, 3 – são acessíveis sob condições fisiológicas e são semelhantes ao ferro podendo ser transportados para dentro da célula pela albumina e transferrina o que reduz a sua toxicidade. Embora ainda o mecanismo de ação dos compelxos de rutênio não esteja completamente compreendido estudos têm idenficado vantagens na utilização de complexos de metais a base de rutênio. O fato de se poder trabalhar com ligantes diferentes ao metal de transição possibilita muitas características e aplicações biológicas diferentes aos complexos de rutênio. Diante dessas possibilidades e para o desenvolvimento deste trabalho decidimos investigarmos a atividade dos complexos de Ru (II) e Ru (III) frente a células tumorais. Por meio de ensaios testamos a atividade dos dois complexos e verificamos que ambos induziram citotoxicidade nas linhagens testadas. O complexo de Ru (III) frente à linhagem tumoral K562 demosntrou induzir citotoxicidade sendo tempo dose dependente. O complexo de rutênio (III) também induziu alteração no ciclo celular e desencadeou o processo de apoptose. O processo de apoptose também foi observado pela degradação do DNA em eletroforese de gel de agarose. Observamos ainda que o rutênio (III) causaou danos na molécula de DNA, mostrando-se tão ativo quanto à cisplatina, provavelmente pela ligação do complexo a fita de DNA. Os estudos sobre os mecanismos de ação dos complexos de rutênio realizados por vários grupos de pesquisa têm evidenciado que a atividade citotóxica de complexos de rutênio sobre células tumorais não é dependente somente do estado de oxidação, mas depende intensamente da estrutura química do composto, atribuindo uma melhor interação com a molécula de DNA. Os ligantes fosfínico presentes no complexo de rutênio (II) desempenham uma função importante na atividade deste composto frente à linhagem tumoral analisada. A estrutura química presente neste complexo de rutênio (II) sugere que o mesmo permite a entrada na 132 célula de forma estável; apresenta ainda alta lipofilicidade, o que pode facilitar a passagem da droga pela membrana celular de natureza lipoproteica; apresenta também estabilidade termodinâmica e cinética que impedem reações indesejadas. O complexo de rutênio II ainda é bastante estável devido ao ligante nitrila que pode establilizar metais em vários estados de oxidação. Em relação ao complexo rutênio (III) devido à presença de ligantes cloro em sua estrutura, sugere-se que o mesmo, sofra alterações através do processo de hidrólise, onde os ligantes cloro, por serem bastante lábeis são substituídos por moléculas de água, semelhante ao mecanismo que ocorre com a cisplatina. Neste estudo, os testes realizados nos leva a inferir o mecanismo de morte celular causado pelos complexos de rutênio aqui testados. Estudos mostram a interação dos complexos de rutênio com biomoléculas, como o DNA, transferrina e albumina os quais são de grande importância para a investigação do mecanismo de ação destes complexos. Sendo que alguns resultados na literatura têm demonstrado a capacidade de complexos de rutênio de interagirem com essas biomoléculas. A partir dos resultados observados neste trabalho e das teorias do mecanismo de ativação de complexos de rutênio (III), entende-se que o complexo de rutênio (III) sofra ativação por redução na célula formando Ru (II), o qual é a forma ativa do complexo que irá se ligar ao DNA. A ligação à molécula de DNA leva a ativação de uma cascata de sinalização como externalização fosfatidilserina, ativação de proteases (caspase-3), e indução de morte celular via apoptose, e necrose possivelmente por fragmentação do DNA. Em relação ao complexo rutênio (II) o qual é a forma ativa do complexo, entende-se que este liga-se ao DNA sem sofrer alterações químicas, levando assim a alteração do potencial de membrana mitocondrial, externalização de fosfafidilserina, liberação e ativação de moléculas apoptogências como Bax, caspases 3 e 8 induzindo de morte da células por via apoptotica. Com os resultados obtidos neste estudo com os complexos de Ru (II e III) sugere-se uma hipótese para o possível mecanismo de ação de ambos os complexos. A hipótese para o complexo de rutênio (III) esta esquimatizado na figura 12, já a hipótese para o complexo de rutênio (II) segue conforme desmosntrado no esquema 1 do artigo 2. 133 8. CONTRIBUIÇÕES EM OUTROS PROJETOS  Contribuição no trabalho de Doutorado do aluno Alcio do curso de pósgraduação em Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Goiás com a realização do teste Anexina V/PI utilizando citometria de fluxo. Trabalho a ser submetido.  Contribuição no trabalho de Doutorado dos alunos Benito Juarez Nunes Alves de Oliveira e Luiz Augusto de Souza do curso de pós-graduação em Veterianaria da faculdade de Veterinaria da Universidade Federal de Goiás com a realização do teste Anexina V/PI utilizando citometria de fluxo. Trabalhos a serem submetidos.  Contribuição no trabalho de Doutorado da aluna Aliny Pereira de Lima do curso de pós-graduação em Biologia Celular e Molecular da faculdade de Biologia da Univesidade Federal de Goiás com a realização do teste de AnexinaV/PI, Ciclo celular e teste JC-1. Um trabalho publicado e o restante em vias de submissão.  Contribuição no trabalho de Mestrado da aluna Paula Roberta Nunes do curso de pós-graduação em Farmácia da Faculdade de Farmacia da Universidade Federal de Goias com a realização dos testes de Anexina V/PI e ciclo celular. Trabalho publicado.  Contribuição no trabalho de Mestrado da aluna Hellen Karine Paes Porto do curso de pos-graduação em Farmacia da Faculdade de Farmacia da Universidade Federal de Goias com a realização dos testes de Anexina V/PI e ciclo celular. Trabalho em vias de submissão.  Contribuição no trabalho de Graduação e Mestrado da aluna Wanessa Carvalho Pires do curso de Bioloiga da Universidade Federal de Goiás com a realização dos testes de Anexina V/PI e ciclo celular. Trabalho em vias de conclusão. 134 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. AIRD, R.E; CUMMINQS, A.A; RITCHIE, M.M; MORRIS, R.E.; CHEN, H; SADLER, P.J.; JODREL, D.I. (2002). In vitro and in vivo activity and cross resistance profiles of novel Ruthenium (II) organometallic arene complexes in human ovarian cancer. British Journal of Cancer 86, 1652. 2. ALAMA, A.; TASSO, B; NOVELLI, F.; SPARATORE, F. (2009). Organometallic compound in oncology: implications of novel organotins as antitumor agents. Drug Discovery Today. v. 14. p. 500-509. 3. ALEKTIAR KM, BRENNAN MF, SINGER S. (2002). Influence of site on the therapeutic ratio of adjuvant radiotherapy in soft-tissue sarcoma of the extremity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 63(1):202-208. 4. ALLARDICE, C.S.; DYSON, P.J. 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