UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

Determinação da estrutura terciária do peptídeo Cn-AMP1 isolado da água do coco verde, por Ressonância Magnética Nuclear (RMN).

Mábio João Santana

Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás como exigência parcial, para obtenção do título de Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr. Luciano Morais Lião Co-Orientadora: Prof.ª Drª Aline Lima de Oliveira

Goiânia
i

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a Deus primeiramente, que me deu forças e coragem para fazer o que eu gosto e chegar até aqui. Aos meus pais Geni Cunha Santana e Rosico Manoel Santana, em memória, responsáveis por me tornar a pessoa que sou. Finalmente dedico aos meus amigos, pelo apoio e compreensão. Meus sinceros

agradecimentos.

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Agradecimentos Ao Prof. Dr. Luciano Morais Lião, mais que orientador é um amigo, pelos ensinamentos e acolhida no grupo de RMN. À Profa. Dra. Aline Lima de Oliveira pela co-orientação, pela contribuição profissional. Ao professor Luiz Keng, pela contribuição e amizade, na realização do trabalho. Agradeço em especial às meninas, Eliane e Carolina Matos que muito colaboraram com o trabalho com dicas valiosas. Aos meus camaradas Wander Brandão, Eliézer, Jaim, Tonisreis, Igor Savióli, Bruno Martinelli, Raca e Flávio Carvalho, pela amizade e companheirismo em todos os momentos. Aos amigos do laboratório de RMN, companheiros de todas as horas, pela ajuda e paciência e companheirismo em tornar o dia-a-dia de trabalho mais descontraído: Alba Dutra, Amanda Cidade, Brenda Carvalho, Caroline Oliveira, Eudécio Dias, Rodolfo Braga, Francisco Gambarra, José Pacífico, Vinicius Silva, Vinicius Souza, Diego e Hellen Cristine. Ao Prof. Dr. Octávio Luiz Franco por gentilmente disponibilizar a amostra. A CAPES pelo apoio financeiro.

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA

iv

SUMÁRIO

Índice de figuras Índice de tabelas Lita de abreviaturas e símbolos Resumo Abstract

vi xii xiii xvi xvii

1.

Introdução 1.1. 1.1.1. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. Aspectos gerais do coco Propriedades Farmacológicas da Água de Coco Peptídeos Peptídeos antimicrobianos - PAMs Surfactantes e micelas PAMs catiônicos PAMs aniônicos Peptídeos Cn-AMPs

1 3 6 7 9 11 11 12 17

1.3.

Determinação da estrutura 3D de peptídeos

19

1.4. 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3.

Ressonância Magnética Nuclear - RMN Deslocamento químico Espectroscopia de RMN bidimensional Efeito nuclear Overhauser - nOe

21 24 26 30

2.

Objetivo

31

3.

Material e métodos 3.1. 3.2. 3.2.1. 3.3. Preparo da amostra Aquisição dos mapas de correlação de RMN 2D Processamento dos dados de RMN Cálculo, geração e análise das estruturas 3D

32 32 34 35 36

v

4.

Resultados e discussão 4.1. 4.1.1. 4.1.2. Análise do TOCSY 2D Peptídeo Cn-AMP1 sem micelas de SDS-d25 Peptídeo Cn-AMP1 sem micelas de SDS-d25 em tampão PBS e pH fisiológico 4.1.3. 4.1.4. Peptídeo Cn-AMP1 com micelas de SDS-d25 Peptídeo Cn-AMP1 com micelas de SDS-d25 em tampão PBS e pH fisiológico

37 37 37

40 43

47

4.2. 4.2.1. 4.2.2.

Análise do NOESY 2D Peptídeo Cn-AMP1 sem micelas de SDS-d25 Peptídeo Cn-AMP1 sem micelas de micelas de SDS-d25 em tampão PBS e pH fisiológico

52 52

53 53

4.2.3. 4.2.4.

Peptídeo Cn-AMP1 com micelas de SDS-d25 Peptídeo Cn-AMP1 com micelas de SDS-d25 em tampão PBS e pH fisiológico

57

4.3. 4.4.

Atribuição sequencial da cadeia peptídica Cálculo e análise das estruturas 3D.

58 60

5.

Conclusões

67

6.

Referências bibliográficas

68

7.

Anexos

Índice de figuras

Figura 1.

Coqueiro da baía, variedade gigante.

3

vi

Figura 2.

Mecanismo geral de formação da ligação peptídica, adaptado de JENSEN, 1992. 7

Figura 3.

Ângulos diedros φ, ψ e ω entre dois resíduos de aminoácidos. Adaptado de METZLER, 2003. 9

Figura 4.

Representação da estrutura química do dodecil sulfato de sódio (SDS). 11

Figura 5.

Representação da estrutura tridimensional do peptídeo Magainin 2. (GESELL et al, 1997). 15

Figura 6.

Representação esquemática dos mecanismos de interação dos PAMs catiônicos e anfipáticos com a membrana celular. (adaptado de NGUYEN et al., 2011). 16 para peptídeos e 20 a região de 22 observado para diferentes núcleos

Figura 7.

Esquema

de

atribuição

sequencial

proteinas. Adaptado de CAVANAGH, 1996. Figura 8. Espectro eletromagnético, destacada

radiofrequência. Figura 9. Efeito Zeeman

magneticamente ativos na presença de campo magnético B 0 na direção z com variações do momento de spin (I). Adaptado de LEVITT, 2008. Figura 10. Representação da estrutura química dos principais padrões de referência utilizados em RMN. Figura 11. Geração de um espectro bidimensional. Adaptado de (RULE e HITCHENS, 2006). Figura 12. Mapa de correlação COSY 2D, identificando as regiões contendo picos cruzados, adaptado de CAVANAGH 1996. Figura 13. Padrão de TOCSY do resíduo de aminoácido glutamina (Gln), adaptado de WÜTHRICH, 1986. 28 27 26 25 23

vii

Figura 14.

Principais correlações ou interações dipolares de núcleos de
1

H entre resíduos de aminoácidos próximos entre si na 31

sequência peptídica (WÜTHRICH, 2003). Figura 15. Espectrômetro Bruker Avance III 500 MHz do Lab. RMN do IQ-UFG. Figura 16. Materiais utilizados nos experimentos de RMN do peptídeo Cn-AMP1: a) suporte, onde o nível central indica a região de cobertura da bobina de excitação/detecção; b) rotor; c) tubo de RMN. Figura 17. Protocolos de processamento dos mapas de contorno do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 Mm, pH 3,97 e 25 ºC realizado utilizando o software NMRPipe® (DELAGLIO et al., 1995), sendo : A) NOESY 2D; B) TOCSY 2D. Figura 18. Identificação dos resíduos e cadeia lateral no TOCSY para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM sem adição de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. Figura 19. Índice de deslocamento químico para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH 3,97 e 25 ºC sem micelas de SDS-d25. Figura 20. Identificação dos resíduos e cadeia lateral no TOCSY para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM sem micelas de SDS-d25, 100 mM, em tampão PBS, pH fisiológico e 25 ºC. Figura 21. Índice de deslocamento químico para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, em tampão PBS, pH fisiológico e 25 ºC sem micelas de SDS-d25. Figura 22. Expansão dos espectros 1D de RMN de
1

32

33

36

37

40

41

42 H, na região

amídica do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH 3,97 e 25 ºC. A) Com micelas de SDS-d25, 100 mM; B) Sem micelas de SDSd25. 43

viii

Figura 23.

Expansão da região de HN-Hα e cadeia lateral do COSY (A) e TOCSY (B), do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM em micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25ºC, as linhas verticais mostram as correlações de cadeia lateral de cada resíduo. 44

Figura 24.

Identificação do sistema de spin em ordem de atribuição dos sinais no mapa de correlação TOCSY para a Val-2 do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, pH 3,97 e 25 ºC. 45

Figura 25.

Índice de deslocamento químico para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. 46

Figura 26.

Identificação dos resíduos e cadeia lateral no TOCSY para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com adição de SDS-d25, 100 mM, pH fisiológico em tampão PBS e 25 ºC. 48

Figura 27.

Identificação do sistema de spins no TOCSY da Val-2 para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, com micelas de SDS-d25, 100mM, em tampão PBS pH fisiológico e 25 ºC. 49

Figura 28.

Índice de deslocamento químico para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH fisiológico em tampão PBS e 25 ºC como micelas de SDS-d25, 100 mM. 50

Figura 29.

Comparação do índice de deslocamento químico (CSI) para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, a 25ºC, A) sem micelas de SDSd25 e pH 3,97; B) sem micelas de SDS-d25 e pH fisiológico; C) com micelas de SDS-d25 (100 mM) e pH 3,97 e D) com micelas de SDS-d25 (100 mM) e pH fisiológico em tampão PBS. 51

Figura 30.

Expansão da região de HN-Hα do mapa de contorno NOESY do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM sem micelas de SDS-d25, pH 3,97 e 25ºC. 52

Figura 31.

Expansão da região de HN-Hα do mapa de contorno NOESY do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM sem micelas de SDS-d25, em tampão PBS, pH fisiológico e 25ºC. 53
ix

Figura 32.

Interações interesiduais observadas no experimento de NOESY devido ao acoplamento dipolar em uma cadeia polipeptídica, na conformação helicoidal. 54 Expansão da região de interação HN – H do mapa de contorno NOESY, mostrando o sinal de nOe que relaciona H N do resíduo Ala-3, com Hα da Val-2, do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. 55

Figura 33.

Figura 34.

Expansão da região de interação Hα - HN do mapa de NOESY, destacando o mapa de conectividade do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, destacadas as interações i, i+2, i+3 e i, i+4, 56 características de estrutura em conformação helicoidal.

Figura 35.

Expansão da região de HN-HN do mapa de NOESY, identificando a conexão entre os resíduos do peptídeo CnAMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. 57

Figura 36.

Expansão da região de HN-Hα, onde são comparados os mapas de TOCSY e NOESY destacando a diferença no número de sinais na região em estudo do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, tampão PBS, pH fisiológico e 25 ºC. 58

Figura 37.

Diagrama de conectividade de nOe, onde as linhas finas, médias e largas indicam as interações fracas, medias e fortes de curta distância, para o peptídeo Cn-APM1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, o retângulo indica a região entre os resíduos onde a sobreposição das interações i, i+3 e i, i+4, características de estruturação em hélice. 59

Figura 38.

Principais interações interesiduais por resíduo, classificadas quando ao tipo, para o peptídeo Cn-APM1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. 60

x

Figura 39.

Diagrama de Ramachandran para as 20 estruturas de menor energia do peptídeo Cn-AMP1; 1 mM com micelas de SDSd25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, destacando as regiões: A) favorecida; B) permitida; C) generosamente permitida; D) proibida, em destaque a distribuição dos resíduos de Gly. 62

Figura 40.

Representação da sobreposição das 20 estruturas de menor energia do peptídeo Cn-AMP1, em diferentes perspectivas, obtidas pelo método de recozimento simulado, para uma solução de peptídeo, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. Onde pode ser observada: A) a formação helicoidal entre os resíduos Ser-1 e Ala-6 e B) a distribuição estrutura. dos resíduos hidrofóbicos (vermelho) na 63

Figura 41.

Representação da projeção de Edmunson para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, onde a intensidade dos vetores indica o índice de hidrofobicidade de cada resíduo. 64

Figura 42.

Representação da região de impressão digital do mapa de correlação TOCSY 2D do peptídeo Cn-AMP1, 1mM, com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25ºC. A) TOCSY original 90% H2O e 10% D2O; B) TOCSY troca H/D, 40% H2O e 60% D2O após 1h e 01 min; C) TOCSY troca H/D, 40% H2O e 60% D2O após 7h e 07 min; D) TOCSY troca H/D, 40% H2O e 60% D2O após 12h e 12 min. 65

Figura 43.

Representação da estrutura de menor energia global do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH 3,97 com micelas de SDS-d25, 100 mM e 25ºC. A cor azul mostra a região de possível interação com a membrana celular. 66

xi

Índice de tabelas

Tabela 1.

Propriedade essenciais.

da

cadeira

lateral

dos

20

aminoácidos

Anexo 1A

Tabela 2. Tabela 3. Tabela 4.

Peptídeos isolados de plantas. PAMs aniônicos isolados de diferentes fontes. Padrões de deslocamento químico dos 20 resíduos de aminoácidos, adaptado de (CHARY e GOVIL, 2008,

10 13

WÜTHRICH, 1986). Tabela 5. Sequência e propriedades químicas dos peptídeos Cn-AMPs, isolados da água de coco, adaptado de MANDAL et al, 2009. Tabela 6. Concentração mínima de inibição dos Cn-AMPs comparados o antibiótico cloranfenicol. (MANDAL et al, 2009; SILVA et al, 2012). Tabela 7. Sensibilidade relativa e constante magnetogírica de alguns núcleos usados como sondas RMN. Tabela 8. Deslocamento químico dos 20 resíduos de aminoácidos em estrutura randômica, em pH 7,0 e 35ºC, adaptado de WÜTHRICH, (1986). Tabela 9. Deslocamento químico observado para os resíduos de aminoácidos da cadeia peptídica do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH 3,97 e 25 ºC sem micelas de SDS-d25. Tabela 10. Deslocamento químico observado para os 20 resíduos de aminoácidos na forma randômica. Adaptado de WISHART et al, 1992. Tabela 11. Restrições do peptídeo Cn-AMP1 em micelas de SDS-d25, pH 3,97 e 25ºC.

Anexo 1B

18

18

24

29

38

39

Anexo 1C

xii

Tabela 12. Deslocamento químico observado para os resíduos de aminoácidos da cadeia peptídica do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, em tampão PBS, pH fisiológico e 25ºC, sem micelas de SDS-d25. Tabela 13. Deslocamento químico observado para os resíduos de aminoácidos do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. Tabela 14. Deslocamento químico observado para os resíduos de aminoácidos da cadeia principal do peptídeo Cn-AMP1, 1 Mm, pH fisiológico em tampão PBS e 25ºC com micelas de SDS-d25,100 Mm. Tabela 15. Dados estatísticos das 20 estruturas de menor energia do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. 61 50 46 42

Lista de abreviaturas e símbolos


(ψ), (φ) e (ω) 1D 2D Å ANVISA AQ B0 B1 Bloc COSY CMI CSI C-terminal

Constante Magnetogírica Ângulos de Torção Experimento Unidimensional Experimento Bidimensional Angstrons Agência Nacional de Vigilância Sanitária Tempo de Aquisição Campo Magnético Estático Campo Oscilante (pulso de rf) Campo Local Espectroscopia de correlação (do inglês Correlated Spectroscopy) Concentração Mínima Inibitória Chemical Shift Index (Índice de Deslocamento Químico) Região Carboxi terminal de um peptídeo
xiii

D2O DQD FAO FID Fmoc ħ HSQC Hz I IRAS J LPS MIC Mixing time / spinlock NOE NOESY

Água deuterada Detecção em Quadratura Food and Agriculture Organization Free Induction Decay (decaimento livre de indução) 9-fluorenilmetoxicarbonila Constante de Planck h/2π Heteronuclear single-quantum correlation Hertz Momento Angular de Spin Infecções Relacionadas à Assistência a Saúde Constante de Acoplamento Escalar Lipopolissacarideos Concentração mínima inibitória (Minimum inhibitory concentration)

Tempo de Mistura Efeito Nuclear Overhauser Espectroscopia de Efeito Nuclear Overhauser (do inglês nuclear Overhauser effect spectroscopy)

NS N-terminal PAMs PBS pH rf RMN RMSD SA SDS t1 t2 TBI tc TD

Número de Transientes Região Amino terminal de um peptídeo Peptídeos Antimicrobianos Tampão fosfato salino (Phosphate buffered saline) Potencial de Hidrogênio Radiofrequência Ressonância Magnética Nuclear Desvio padrão quadrático médio (do inglês root mean square deviation) Arrefecimento simulado (do inglês Simulated Annealing) Dodessilsulfato de sódio Tempo de Evolução Indireta Tempo de Detecção Triple Resonance broadband Inverse probehead Tempo de Correlação Dwell time (número de pontos do FID)

xiv

TF TMS TOCSY ʋ ʋL W0 W2 δ ΔE ζ

Transformada de Fourier Tetrametilsilano Espectroscopia de Correlação Total (do inglês T otal Correlation SpectroscopY) Frequência Frequência de Larmor Zero Quantum Coherence Double Quantum Coherence Deslocamento Químico Diferença de energia entre os estados de spin Tensor / constante de blindagem

xv

Resumo

O presente trabalho tem como objetivo determinar e analisar a estrutura tridimensional em conformação de menor energia do peptídeo Cn-AMP1, isolado da água de coco verde por RMN de 1H. A determinação da estrutura 3D do peptídeo em estudo foi realizada através de experimentos de RMN de 1H homonuclear de COSY, TOCSY e NOESY, utilizando uma solução 1 mM do peptídeo Cn-AMP1, em espectrômetro BRUKER AVANCE III de 500 MHz, para o núcleo de hidrogênio. A análise dos mapas de correlação foram feitas usando o software NMRView, e a metodologia adotada foi a atribuição sequencial descrita por Wüthrich, onde foram geradas 200 estruturas e escolhidas as 20 conformações de menor energia global para representar a estrutura tridimensional do peptídeo Cn-AMP1. O peptídeo apresentou estruturação em hélice entre os resíduos Ser-1 e Ala-6, em micelas de SDS-d25, 100 mM, se estruturando randomicamente entre os resíduos Gln-7 e Met-9. No entanto, em condições de pH fisiológico, assim como na ausência de micelas de SDS-d25, o peptídeo não apresentou estrutura em hélice, prevalecendo a forma randômica.

Palavras chave: peptídeo; estrutura 3D; SDS micelas, cocos nucífera.

xvi

Abstract

This study aims to determine and analyze the three-dimensional structure in the lowest energy conformation of the peptide Cn-AMP1, isolated from green coconut water by 1H NMR. The determination of the 3D structure of the peptide under study was performed by homonuclear 2D
1

H NMR experiments COSY, TOCSY and

NOESY, using a 1 mM solution of the peptide Cn-AMP1 on Bruker AVANCE III 500 MHz (for 1H). The analysis of the correlation maps were made using the software NMRView, and the methodology adopted was the allocation sequence described by Wüthrich, where 200 structures were generated and selected the 20 lowest energy conformations to represent the overall three-dimensional structure Cn-AMP1 peptide. The peptide showed helical structure between residues Ser-1and Ala-6 in SDS- d25 micelles, 100 mM being structured randomly between residues Gln-7 and Met-9. However, under conditions of physiological pH, as in the absence of SDS micelles d25, the peptide showed no helix structure, predominating is randomly. Keywords: peptide; 3D structure, SDS micelles, Cocos nucifera.

xvii

1. Introdução

As infecções relacionadas à assistência a saúde (IRAS) são definidas como aquelas, que são adquiridas após a admissão do paciente na unidade de saúde, com manifestação durante a internação ou após a alta, devido a procedimentos durante esse período. As IRAS são diagnosticadas, em geral, a partir de 72 horas após a internação e ganharam proporções de problema mundial de saúde pública, devido à prevalência, morbimortalidade e prejuízos causados no âmbito pessoal, profissional e emocional, provocando a elevação do custo assistencial e o tempo de internação do paciente (OLIVEIRA, 2005; SIEGEL et al., 2007; TENOVER, 2006). No Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde a taxa global de infecções é de 14%, dos quais 9% evoluem a óbito. Quando se trata de pacientes com mais de 60 anos essa taxa é de 23,6%, como causa direta ou associada a essas infecções. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010; SANTOS et al., 2005, VILLAS BÔAS e RUIZ, 2004). As IRAS têm suas consequências potencializadas quando os patógenos apresentam perfil resistente aos antibióticos ministrados, definindo assim um quadro de resistência múltipla aos medicamentos em uso (MENDONÇA, 1997). Ao longo das últimas décadas tem se observado o uso excessivo e não criterioso de antibióticos em ambulatórios, em pacientes hospitalizados e na indústria alimentícia. Esses fatores são preponderantes no aumento da resistência bacteriana frente aos medicamentos convencionais. Cerca de 70% dos patógenos isolados em hospitais americanos resistem pelo menos a um antibiótico (SIEGEL et al., 2006). Assim novas substâncias que possam atuar de maneira eficaz contra microrganismos desperta grande interesse dos pesquisadores, visando o desenvolvimento de compostos alternativos aos medicamentos estabelecidos (ANVISA, 2008). Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) compõem a defesa natural da maioria dos organismos contra a invasão de patógenos, sendo considerada parte integrante do sistema imune inato. Os PAMs geralmente podem ser expressos ou induzidos, como resposta a uma infecção, sendo produzidos de forma predominante nos tecidos como pele, olhos e pulmões, onde a exposição a microrganismos patogênicos é mais acentuada. No entanto esses peptídeos são biossintetizados em concentrações baixíssimas, sendo necessário utilizar métodos de síntese artificial,
1

como a síntese em fase sólida (SPFS). A técnica se baseia em ancorar os aminoácidos através de ligantes em um suporte sólido, insolúvel tanto em meio aquoso quanto em solventes orgânicos, permitindo obter ou modificar cadeias peptídicas (AMBLARD et al., 2006). Os PAMs se apresentam como uma alternativa promissora aos antibióticos tradicionais (PAPO e SHAI, 2003). Os efeitos deletérios ao crescimento celular ocorrem devido à interação do peptídeo com a bicamada fosfolipídica da membrana celular da bactéria, através de mecanismos de ação específicos. Os PAMs têm modos de ação variados tais como: rompimento da membrana celular ou ação junto aos componentes citoplasmáticos do patógeno (SARIKA et al, 2012). Os modelos de ação geralmente encontrados na literatura são: Barril, Toroidal e Carpete (YEAMAN e YOUNT, 2003), ou ainda mecanismos que não envolvem a perturbação da membrana (JANG et al, 2012). Esses modelos serão discutidos no decorrer deste trabalho. Os PAMs atuam geralmente em baixa concentração, contra amplo espectro de patógenos, como: protozoários, vírus, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Em sua maioria são tóxicos para bactérias, no entanto, a ação desses peptídeos frente a células eucarióticas que contem colesterol é bastante atenuada (WU et al 2010). Algumas linhagens demonstram ainda ser eficazes contra bactérias resistentes a antibióticos convencionais. Outra vantagem é que eles têm como fonte biológica espécies de diferentes reinos da natureza (F. HOU et al, 2011). Esses fatos colocam os PAMs como promissores candidatos ao desenvolvimento de novos fármacos. As plantas representam um universo vasto que contém substâncias com potencial atividade biológica, funcionando como barreira contra a ação de agentes nocivos. Dessa forma, a biodiversidade encontrada na região intertropical representa uma rica fonte, para investigação, isolamento e extração de compostos, que servirão de base para o desenvolvimento de possíveis novos fármacos. Entre estas substâncias destaca-se: Cp-thionin-2 isolado da Vigna unguiculata (feijão fradinho) (FRANCO et al, 2006), Circulin-A isolado da Chassalia parviflora (GUSTAFSON, 1994) e os Cn-AMPs isolados da água do fruto de Cocos nucifera (Coqueiro da baía). (MANDAL, 2009).

2

1.1. Aspectos Gerais do Coco O coqueiro, conhecido no Brasil como coqueiro da baía, coqueiro da praia ou coqueiro gigante (Figura 1) é uma cultura tropical, da classe das angiospermas, subclasse Monocotyledoneae, ordem Principes (Arecales), família Palmae

(Arecaceae), tribo Cocoidae, gênero Cocos e espécie Cocos nucifera L. Dentro do gênero Cocos, ocorrem duas variedades principais: typica Nar (variedade gigante) e nana Griff (variedade anã). O coqueiro se encontra amplamente distribuído nas regiões costeiras da Ásia, África, América Latina e região do Pacífico. (SIQUEIRA, 2002). O consenso entre os estudiosos é que, essa cultura tenha se originado no sudoeste do pacífico e se distribuído provavelmente de forma pantropical para outros continentes (PARROTA, 1993).

Figura 1. Coqueiro da baía, variedade gigante.

O coqueiro é um gênero monotípico, inerme, solitária, de estirpe cilíndrica, podendo alcançar altura de 35m (gigante), 20m (híbrido) e 10m a 12m (anão) (LOIOLA; ARAGÃO, 2008). Pode apresentar ainda, entre 20 e 30 cm de diâmetro na parte superior, 70 cm de diâmetro na base e copa com até 25 folhas no auge do seu desenvolvimento (PARROTA, 1993).

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O coqueiro produz flores masculinas e femininas em uma mesma inflorescência (espádice), inseridas em uma espata lenhosa de 60 a 120 cm de comprimento, que se abre durante o florescimento. A espata é formada na base da folha, sendo constituída de pedúnculo e ráquilas. O número de flores masculinas oscila de várias dezenas a centenas, com dimensão de alguns milímetros, dispostas em espigas localizadas na parte superior da ráquila. As flores femininas se desenvolvem, em forma de botões arredondados, localizados na base da ráquila, com diâmetro de 15 a 25 mm, cuja quantidade varia de 0 a 9. Tais flores apresentam três estigmas e três óvulos, dos quais apenas um não aborta. O número de flores femininas pode variar entre as inflorescências de uma mesma planta, e também entre coqueiros da mesma idade a depender da natureza da planta, tratos culturais ou estação do ano. As inflorescências são emitidas, de 12 a 15 por ano, de forma sucessiva e contínua, com intervalo de 24 a 30 dias de uma para outra, apresentando quase sempre a mesma quantidade de espádices e de folhas, em torno de doze por ano. Dessa forma a produção de folhas afeta de forma efetiva a produção de espádice, influenciando diretamente a polinização. A abertura da espata marca o inicio da fase masculina da inflorescência, que perdura entre 10 e 22 dias, se encerrando com a queda da última flor. Essa fase pode variar de acordo com a natureza da planta, localidade e estação do ano. As flores se abrem durante o dia, na sua maioria entre 8 e 10 horas da manhã, permanecendo aberta durante cerca de dois dias. A maioria se abre 15 dias após a abertura da espata. A duração da fase feminina se inicia, com a abertura completa do estigma e se encerra com a mudança de coloração do mesmo passando a róseo-pardo, esse período pode variar também com a natureza e condições da planta. As flores podem ser polinizadas do 2º ao 4º dia, quando se abrem e secretam o néctar. A duração da fase feminina é em geral muito curta quando comparada com a masculina durando de 5 a 12 dias, a depender dos fatores citados anteriormente, além do número de flores femininas de cada inflorescência. A natureza da polinização depende diretamente do comportamento simultâneo das fases masculina e feminina, na mesma inflorescência, dando origem a polinização cruzada quando não há simultaneidade e autopolinização, quando os processos são simultâneos (MEDINA, 1980). A polinização cruzada é característica predominante nos coqueiros da variedade gigante, com as flores masculinas amadurecendo de forma assíncrona
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frente á receptividade das flores femininas dentro da inflorescência. Porém quando existe sincronismo entre o amadurecimento das flores masculinas e a abertura das flores femininas, ou em caso de sobreposição de inflorescências ocorrerá autopolinização, que é uma característica dos coqueiros da variedade anã (SIQUEIRA, 2002). O coqueiro foi introduzido no Brasil em 1553, no Estado da Bahia, trazido das ilhas de Cabo Verde e disseminado pelo litoral, onde encontra condições edafoclimáticas ideais para o seu desenvolvimento (SIQUEIRA, 2002). Por ser tipicamente uma planta tropical, seu cultivo é apropriado em regiões entre as latitudes 26ºN e 26ºS, onde a temperatura média é em torno de 27ºC, com variação diurna de 6ºC a 7ºC, (SIQUEIRA, 2002; MURRAY, 1975). As precipitações pluviométricas devem ser bem distribuídas durante todo o ano. As áreas tropicais litorâneas apresentam solo arenoso, que, associado ao efeito regulador do oceano sobre a temperatura, oferece condições ideais para o seu desenvolvimento. (FERREIRA, 1998). Conhecido pelos indianos como “árvore da vida”, o coqueiro tem múltiplos usos e finalidades, representando uma boa fonte de alimento, energia e renda através de seus produtos e subprodutos, tais como: casca, fibras, coque, polpa (álbumem sólido) e água (álbumem líquido) (ARAGÃO, 2001), podendo ser consumido in natura ou industrializado em mais de 360 formas. O aproveitamento vai desde as folhas utilizadas para cobertura de abrigos, troncos usados como pilares, além da raiz e inflorescência, usadas no artesanato (PARROTA, 1993). O coqueiro é cultivado em mais de 86 países situados na zona intertropical e do ponto de vista agronômico desempenha um papel muito importante, visto que 96% da produção mundial provem de pequenos produtores. Cerca de 70% da produção é consumida internamente nos países de origem. Dessa forma, representa o principal produto, agroindustrial, socioeconômico e fonte de alimentação humana, tendo a possibilidade de se obter dele a copra (polpa), o óleo de coco, leite de coco e ração (ARAGÃO, 2002a). Segundo a FAO (Food and Agriculture Organization), a produção mundial de coco chega a 60,7 milhões de toneladas, para uma área de 11,2 milhões de hectares cultivados. Cerca de 80% da produção provém de países situados na Ásia, destacando a Indonésia como maior produtor mundial, seguido pelas Filipinas, Índia e Brasil. (FAO, 2011).
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O Brasil se destaca no cenário mundial pelo cultivo de coco verde, destinado à produção de água para o consumo in natura, sendo a região Nordeste responsável por 85,6% da produção nacional, com área plantada de aproximadamente 280.835 ha. A variedade Anã verde é cultivada de forma predominante, por apresentar maior produtividade, rendimento e qualidade da água. (NETO et al, 2011). O fruto do coqueiro é, botanicamente, uma drupa. Sua constituição é composta de uma epiderme lisa ou epicarpo, envolvendo uma camada espessa e fibrosa denominada mesocarpo e mais ao interior uma camada dura denominada endocarpo. Protegendo a semente é formada uma camada fina de tegumento de cor marrom, localizado entre o endocarpo e o albúmen sólido (endosperma ou polpa). Este último é constituído de uma camada carnosa, branca, muito oleosa, formando uma cavidade interna onde se localiza o albúmen liquido (água de coco). O embrião se localiza próximo a um dos três orifícios do endocarpo ficando envolvido pelo albúmen sólido (HOLANDA, 2004).

1.1.1. Propriedades Farmacológicas da Água de Coco

O albúmen líquido, também denominando de água de coco é formado na cavidade interna do fruto, cerca de dois meses após a inflorescência e desempenha a função de reserva de nutrientes durante a germinação, atingindo seu volume máximo entre os seis e sete meses a partir da infloração (MEDINA, 1980; ARAGÃO, 2002b). Trata-se de uma excelente bebida natural, que apresenta baixo valor calórico, possui também propriedades nutritivas, agindo uma bebida isotônica natural e repondo os eletrólitos perdidos durante a atividade física, devido ao seu teor elevado de potássio (MEDINA, 1980). O seu uso envolve ainda aplicações na forma de soro oral ou intravenoso nos casos de cólera, problemas intestinais e estomacais (ANZALDO, et al, 1985), além de outras propriedades como: energética, anti-helmíntica, tenicida e diurética, podendo ainda ser utilizada na preservação de sêmen animal (SALGUEIRO, 2001). A água de coco pode ser consumida naturalmente ou industrializada. A sua composição química conta com: vitamina B, ácido nicotínico B3, ácido pantotênico B5, biotina, riboflavina B2, ácido fólico, traços de tiamina B1 e piridoxina B6. Contêm ainda, açúcares, álcoois, vitamina C, fitormônios, enzimas e promotores do crescimento. Esse conjunto propicia a ação
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antioxidante protegendo o organismo contra a ação dos radicais livres, atuando ainda no sistema imunológico, na absorção de ferro e também na prevenção de câncer de pulmão e estômago (MANDAL, 2011). A composição da água de coco conta ainda com peptídeos, como a série: CnAMP1, Cn-AMP2 e Cn-AMP3, isolados da água de coco e relatados no trabalho de Santi M. Mandal (Mandal, 2009), os quais apresentam atividade antimicrobiana. Podem ser encontrados também, aminoácidos livres como: prolina, valina, leucina, serina, alanina, treonina (MAGNAVAL, 1995).

1.2.

Peptídeos

Os aminoácidos são os constituintes fundamentais de biomoléculas, desde as mais antigas linhagens de bactérias até as formas de vida mais evoluídas. Para arquitetar a estrutura dessas moléculas biológicas é utilizado um conjunto de 20 aminoácidos apresentados no Anexo 1A. Tais aminoácidos são dotados de um grupamento carboxila e um grupo amina. Esses grupos protagonizam uma reação de condensação originando uma ligação covalente denominada, ligação peptídica (Figura 2), formando as biomoléculas (LEHNINGER, 1982).

Figura. 2 – Mecanismo geral de formação da ligação peptídica, adaptado de JENSEN, 1992.
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A ligação covalente formada entre o carbono da carbonila e o nitrogênio tem caráter parcial de dupla, devido ao efeito de ressonância. Uma consequência importante decorrente desse efeito é que, o comprimento de 1,32 Å da ligação peptídica é menor que o esperado para uma ligação simples C-N, cujo valor é de 1,45 Å. No entanto esse valor supera a ligação dupla C=N, de 1,25 Å, enfatizando assim o caráter intermediário desta ligação (WHITFORD, 2011). A deslocalização eletrônica no sistema π, envolvendo os átomos de O, C e N, torna a ligação amídica planar. Assim a rotação em torno dessa ligação torna-se restrita. A rigidez observada na ligação peptídica mantém os átomos envolvidos coplanares. Os planos formados dão origem às configurações trans e cis, separadas por um ângulo de 180º. A orientação dos planos que contém a ligação peptídica é determinada pelos ângulos psi (ψ), phi (φ) e ômega (ω), denominados ângulos de torção. O ângulo (ω), formado em torno da ligação C - N assume o valor de 0, quando a estrutura se encontra na forma planar cis e 180º, quando esta se encontra na configuração trans. O ângulo phi (φ) mede a rotação em torno da ligação N - Cα de um mesmo resíduo, dessa forma, quando φ = 0 indica uma configuração cis, envolvendo os carbonos carbonílicos dos resíduos i-1 e i. O ângulo psi (ψ) mede a rotação em torno da ligação Cα - C dentro do mesmo resíduo. Quando ψ=0 ocorre configuração cis entre os átomos de nitrogênio presentes nos resíduos i e i+1. A variação desses ângulos é provocada por interações locais na cadeia principal da unidade peptídica. Essas interações são suficientemente fortes para gerar restrições à liberdade de torção, influenciando profundamente na estrutura tridimensional da molécula (METZLER, 2003; CHAKRABARTI, 2001; WHITFORD, 2011). As ligações entre o carbono alfa e os grupos alfa-amino ou alfa-carboxila tem liberdade de rotação, embora limitada pelo tamanho e caráter do grupo R que constitui a cadeia lateral de cada resíduo. Uma vez que os ângulos Φ e ψ podem variar para os resíduos individualmente, torna possível um grande número de conformações. A forma trans é encontrada com maior frequência devido a menor interferência estérica, entre os grupos da cadeia lateral e consequentemente menor energia. No entanto, conformações onde, os átomos se aproximam a uma distância equivalente ao raio de Van der Waals devem ser desconsideradas, por desestabilizar a estrutura (WHITFORD, 2011). A Figura 3 mostra os ângulos Φ, ψ e ω de um fragmento de cadeia peptídica (METZLER, 2003; WHITFORD, 2011).

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Figura 3. Ângulos diedros φ, ψ e ω entre dois resíduos de aminoácidos. Adaptado de METZLER, 2003.

1.2.1. Peptídeos Antimicrobianos (PAMs)

Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são moléculas de massa molecular menor que 10 kDa, com menos de 50 resíduos de aminoácidos (HANCOCK e SCOTT, 2000; JANG et al, 2012), podendo variar nas estruturas primária, secundária e terciária. Os PAMs estão distribuídos entre animais, plantas, fungos e bactérias (ZHANG 2008). As plantas contribuem com 13,52% dos PAMs identificados até o momento, o que representa um total de 261, distribuídos em dez classes, onde algumas são apresentadas na Tabela 2 (GARCÍA-OLMEDO et al 1998; 2001; SARIKA et al, 2012).

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Tabela 2. Peptídeos isolados de plantas. Peptídeo Gamma 1-hordothionin Estrutura Classe Tioninas Referência BRUIX et al, 1993

VrD2

Defensinas

LIN et al, 2007

WAMP-1a

Heveínas

DUBOVSKII et al, 2011

EcAMP1

-

NOLDE et al, 2011

MiAMP1

-

MARCUS et al, 1997

Circulin A

Ciclotideos

DALY et al, 1999

Os PAMs assumem diferentes conformações tridimensionais que podem ser agrupadas em quatro tipos, sendo: α-hélices, estabilizados por interação de hidrogênio; o tipo folha-β, estabilizado por ligação dissulfeto e que podem apresentar fragmentos em α-hélices; outras menos comuns como estruturas curvas e estendidas (Rezende et al, 2008). A maioria dos peptídeos se organiza de forma anfipática, onde os resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos se orientam em faces opostas da estrutura, facilitando o contato com a superfície da membrana. Essa interação induz os PAMs a assumir estruturas tridimensionais variadas, como alfa hélices e folhas beta, em decorrência da mistura de interações intra e intermolecular. No entanto, em solução aquosa os PAMs tendem a se organizar de forma randômica, devido à redução ou ausência de interações intermoleculares. A tênue estabilidade
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das estruturas em hélice pode ser quebrada por diversos fatores, tais como a disposição dos aminoácidos na sequência primária do peptídeo, a repulsão entre cadeias laterais carregadas (positiva ou negativa) e também pela proximidade entre os resíduos (PAPO e SHAI, 2003). Em sua maioria os PAMs possuem carga, em geral, positiva, sendo assim denominados catiônicos, no entanto há um considerável número de peptídeos de bactérias carregados negativamente, conhecidos como aniônicos.

1.2.2. Surfactantes e micelas

Os agentes tensoativos são substâncias dotadas de centros hidrofílicos e hidrofóbicos, que conferem o caráter anfipático à molécula. Outra característica dos surfactantes é o fato de formarem micelas em água, orientando a porção hidrofílica para o meio aquoso e a porção hidrofóbica voltada para o interior da micela. As micelas mimetizam de maneira eficiente o meio celular, dessa forma elas são utilizadas em estudos da estrutura tridimensional de peptídeos e proteínas. A interação das biomoléculas ocorre com a superfície hidrofílica da micela, assumindo assim uma estrutura tridimensional. Há uma série de surfactantes disponíveis como o dodecil sulfato de sódio (SDS), Figura 4. O SDS apresenta grupos fosfatos hidrofílicos, que formam micelas de boa estabilidade e dimensão da ordem de 14,1±0,1 Å a 20,9±0,1 Å (HAMMOUDA, 2013).

O- Na+ O S O O

SDS
Figura 4. Representação da estrutura química do dodecil sulfato de sódio (SDS).

1.2.3. PAMs catiônicos

Os PAMs catiônicos se encontram distribuídos entre animais e plantas, sendo isolados em grande número a partir de insetos e da pele de rã, esses peptídeos
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apresentam em comum entre si algumas características, como a modificação por clivagem, glicosilação ou halogenação, sendo divididos em subfamílias que se diferenciam por características estruturais como: as defensinas, que são peptídeos lineares formando estruturas helicoidais e as cecropinas, peptídeos abertos e ricos em cisteinas estabilizados por pontes de dissulfetos e tioninas que apresentam prolina, glicina e histidina, além de outros que são ricos em Triptofano (SARIKA et al, 2012). Muitos desses peptídeos apresentam quantidade considerável de resíduos hidrofóbicos (> 30%), atuando a uma concentração mínima inibitória (Minimum inhibitory concentration - MIC) na ordem de 0,25 até 4 μg/mL. A MIC corresponde à menor concentração do antimicrobiano capaz de inibir o desenvolvimento visível do microrganismo. Os antibióticos convencionais como a ampicilina apresenta contra cepas de Bastonetes Gran negativos da família Enterobacteriaceae, MIC50 de 256,0 μg/ml, enquanto o cloranfenicol apresenta MIC50 de 16,0 μg/ml, contra a mesma cepa (NASCIMENTO et al, 2009). Além dessas características os PAMs apresentam caráter anfipático, ação rápida contra amplo espectro de patógenos. Esses fatores fazem desses peptídeos possíveis alternativas aos antibióticos convencionais amplamente utilizados (HANCOCK et al 1998; 2002; JANG et al, 2012).

1.2.4. PAMs aniônicos

O primeiro relato de PAMs aniônicos consta da década de 1980, esses peptídeos têm como característica a carga liquida negativa variando de -1 a -7, com um tamanho entre 5 a 70 resíduos. O número de PAMs aniônicos é menor quando comparado aos catiônicos. Tais peptídeos aniônicos podem isolados principalmente de mamíferos, e seu modo de ação envolve a orientação anfipática quando em contato com a membrana assumindo estrutura helicoidal, como observado nos peptídeos isolados de anfíbios ou em estrutura cíclica nó cistina como observado em certas proteínas vegetais. A interação desses peptídeos com o organismo envolve a utilização de íons metálicos formando ponte de sal catiônico com os centros carregados negativamente da membrana. Os PAMs aniônicos podem ser classificados em: neuropeptídios; moléculas ricas em ácido aspártico; aromáticos e proteínas de ligação de hidrogênio (HARRIS et al, 2009) . Alguns representantes desses peptídeos são apresentados na Tabela 3.

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Tabela 3. PAMs aniônicos isolados de diferentes fontes. Peptídeo / fonte Enkelytin (ruminantes) Sequência Referência

FAEPLPSEEEGESYSKEVPEMEKRYGGFM

METZBOUTIGUE et al, 1998 TANG Y.Q. et al, 2002

Fibrinopeptide B (homo sapiens) Temporin-1Ja (anfíbios) PvHCt (crustáceos)

QGVNDNEEGFFSAR

ILPLVGNLLNDLL-NH2 FEDLPNFGHIQLKVFNHGEHIHH

ISAACSON T. et al, 2002 DESTOUMIEUXGARZON et al, 2001 SALZET M. et al, 2003

Chromacin (anelídeos e moluscos)

GDFELPSIADPQATFESQRGPSAQQVDK

Os PAMs apresentam domínios hidrofílicos carregados positivamente, os quais interagem com os grupos fosfolipídeos negativos presentes na superfície celular. A interação com a membrana desencadeia diversos modos de ação do peptídeo, como os disruptivos que levam a lise celular através do aumento da permeabilidade da membrana aos íons ou moléculas maiores. Há também modos de ação que induz mudanças estruturais na membrana, com a formação de poros transientes e o transporte de peptídeos para o interior da célula, com o ataque a alvos intracelulares. (HANEY et al, 2012; LAM et al, 2012). O modo de ação de muitos PAMs está associado à interação do peptídeo com a membrana, quando o peptídeo adota diferentes estruturas tridimensionais. Essas estruturas são dotadas de elementos estruturais interdependentes entre si, tais como: a afipaticidade (A); a hidrofobicidade (H); a conformação (Χ); a carga (Q) e o ângulo polar (θ). Esses fatores regulam não só as propriedades químicas (carga, anfipaticidade e hidrofobicidade), como também a conformação tridimensional (conformação e ângulo polar). No entanto, as variações na composição da sequência e nas ligações intramoleculares, também podem afetar a relação
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estrutura-atividade do peptídeo, seja em solução, associados a membranas ou em estados ativados na transição de fases conformacional. A hidrofilicidade é representada pelos resíduos que tem afinidade ao meio aquoso, esses resíduos podem apresentar cadeia lateral carregada positivamente. A seletividade do peptídeo decorre provavelmente da afinidade de carga entre os domínios hidrofílicos positivos, do peptídeo e grupos fosfolipídeos negativos da membrana, o que leva a aproximação inicial de natureza eletrostática entre o peptídeo e a membrana celular. Dessa forma a carga representa a força motriz dos mecanismos de ação do peptídeo, juntamente com os fatores estruturais. A hidrofobicidade (H) indica a porcentagem de resíduos hidrofóbicos dentro do peptídeo, sendo da ordem de 50% para a maioria dos PAMs. Esse parâmetro tem grande importância para a atividade dos PAMs, porque controla a extensão de partição do peptídeo junto ao núcleo hidrofóbico da bicamada lipídica, facilitando a permeabilização da membrana. No entanto, estudos mostram que um aumento da hidrofobicidade se correlaciona com um aumento da atividade hemolítica. Dessa forma, como anfipaticidade é definida pelo o momento hidrofóbico, uma taxa elevada desse fator está relacionada ao aumento da atividade biológica e também da atividade hemolítica do peptídeo. Além disso, o aumento da hidrofobicidade tende a levar os peptídeos a um estado de agregação na forma de dímero ou oligômero, reduzindo a ação antimicrobiana, tendo em vista o maior gasto energético necessário para se estruturar e atuar efetivamente na partição da membrana. Todo esse conjunto de fatores influencia as propriedades bioquímicas do peptídeo (TEIXEIRA et al, 2012). A anfipaticidade (A) reflete a abundância relativa e a polarização dos domínios, hidrofóbicos e hidrofílicos do peptídeo, quando interage com a superfície da célula alvo. O valor quantitativo da anfipaticidade é obtido pelo momento hidrofóbico, calculado pela soma vetorial das hidrofobicidade dos resíduos de aminoácidos, referenciados para uma hélice ideal. Esse parâmetro se relaciona com a atividade hemolítica do peptídeo (TEIXEIRA et al, 2012). A conformação (Χ) e o ângulo polar (θ) regulam a configuração tridimensional dos PAMs. O ângulo polar indica a porporcionalidade entre as faces polar e apolar quando o peptideo assume uma conformação em helice anfipática. Um valor reduzido de ângulo polar se traduz em uma superfície mais hidrofóbica, levando a maior capacidade de permeabilização da membrana pelo peptídeo. Estes elementos
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possuem interação sinérgica entre si e influenciam na interação com a membrana, por meio da formação de estruturas como as α-hélices frequentemente observadas nos PAMs, como a classe das magaininas mostrada na Figura 5. (YEAMAN e YOUNT, 2003; TEIXEIRA et al, 2012).

Figura 5. Representação da estrutura tridimensional do peptídeo Magainin 2. (GESELL et

al, 1997).

Na literatura são sugeridos mecanismos pelos quais os PAMs atuam frente a membranas de células hospedeiras. A ação desses peptídeos envolve a interação com a membrana bacteriana, diferentemente da maioria dos antibióticos que atuam junto a proteínas específicas reduzindo a possibilidade do desenvolvimento de resistência por parte do organismo alvo. Esses mecanismos envolvem geralmente duas propriedades comuns aos PAMs: a natureza catiônica e a hidrofobicidade, sendo que o primeiro fator promove a seletividade do peptídeo para membranas contendo domínios carregados negativamente na superfície, e o segundo facilita a interação com tais membranas. O modo de ação dos PAMs envolve geralmente a perturbação da membrana bacteriana de várias formas conforme pode ser observado na Figura 6, sendo descritos com maior frequência na literatura os modelos: barril, toroidal, carpete e canal agregado. (NGUYEN et al., 2011)

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Figura 6. Representação esquemática dos mecanismos de interação dos PAMs catiônicos e anfipáticos com a membrana celular. (adaptado de NGUYEN et al., 2011). O modelo denominado “Barril” apresenta superfícies hidrofóbicas da alfa hélice ou folha beta, orientadas na direção das cadeias acil da membrana. Esse mecanismo forma poros na ligação do peptídeo à superfície celular, nesse ponto o peptídeo passa a um estado excitado onde, a porção hidrofóbica é inserida na membrana, enquanto a face hidrofílica forma um revestimento poroso. Ao atingir um limiar de concentração de monômeros, ocorre autoagregação dos peptídeos, formando gradiente de concentração na superfície. A partir desse limiar tem-se a expansão do poro permitindo o transporte de mais peptídeos para o interior da célula, provocando o extravasamento da mesma (TEIXEIRA et al, 2012). O modelo “Toroidal”, também conhecido como “Buraco de Minhoca”, é o modelo melhor caracterizado e sua ação envolve a formação de estrutura em alfa hélice, que é inicialmente orientada paralelamente a superfície da membrana, onde os resíduos hidrofóbicos deslocam os grupos polares forçando a curvatura da
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superfície positiva da membrana. Assim ao atingir a concentração limite os peptídeos são orientados perpendicularmente à superfície da membrana e inseridos no interior da célula (HARA et al., 2001). O terceiro modelo de interação é denominado “Carpete”, que envolve efeitos difusos interpretados como o efeito de um detergente, onde é acumulada uma densidade elevada de peptídeos na superfície da célula alvo. Como todos os outros mecanismos, a interação inicial se dá provavelmente por atração eletrostática e quando o limiar de concentração é atingido, a integridade da membrana é perdida, semelhante à dispersão, não envolvendo a formação de canais. Dessa forma o peptídeo não necessita ser inserido na interface celular (YEAMAN e YOUNT, 2003). O quarto modelo de interação é denominado canal agregado. Nesse modelo ocorre um deslocamento de lipopolissacarideos (LPS) associados a cátions bivalentes (Mg+2 e Ca+2), havendo a perturbação da membrana pela formação de domínios lipídicos de peptídeos. Os agregados formados proporcionam canais de fuga para íons através da membrana, provocando a ruptura e morte celular. (LI, et al, 2012) Há ainda peptídeos como Buforin II e Buforin IIb que apresentam um único mecanismo, onde não ocorre a perturbação da membrana da célula alvo. O modo de ação desses peptídeos, diferentemente da maioria dos PAMs que matam as bactérias via ruptura da membrana e a translocação para dentro da célula patogênica. Quando se encontram no interior da célula, os peptídeos agem sobre alvos intracelulares inibindo a transcrição ou a tradução celular, pela interação com os ácidos nucléicos (JANG et al, 2012).

1.2.5. Peptídeos Cn-AMPS Os peptídeos Cn-AMPs, em particular o Cn-AMP1, objeto desse trabalho, foram originalmente isolados da água de coco verde (MANDAL et al, 2009) em uma série de três, denominados Cn-AMP1, Cn-AMP2 e Cn-AMP3. As sequências primárias assim como algumas propriedades químicas de cada peptídeo são apresentadas na Tabela 5.

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Tabela 5. Sequência e propriedades químicas dos peptídeos Cn-AMPs, isolados da água de coco, adaptado de MANDAL et al, 2009. Peptídeo Sequência Massa Massa calculada observada (Da) (Da) 876 1266 967 858 1249 950 Taxa hidrofóbica (%) 44 45 37 Carga

Cn-AMP1 Cn-AMP2 Cn-AMP3

SVAGRAQGM TESYFVFSVGM YCSYTMEA

+1 -1 -1

Os três peptídeos apresentam-se ativos contra bactérias patogênicas Grampositivas e Gram-negativas, sendo Cn-AMP1 o que apresentou maior atividade contra quatro cepas de bactérias (E. coli, B. subtilis, S. aureus, e P. aeruginosa), conforme mostra a Tabela 6. Tabela 6. Concentração mínima de inibição dos Cn-AMPs comparados o antibiótico cloranfenicol. (MANDAL et al, 2009; SILVA et al, 2012) Concentração Mínima de Inibição - CMI Bactéria E. Coli B. subtilis P. aeruginosa S. aureus Cn-AMP1 (μM) 18 36 9 18 Cn-AMP2 (μM) 136 120 135 136 Cn-AMP3 (μM) 318 270 272 288 Cloranfenicol (μM) 55 110 22,5 55

O Cn-AMP1 é um peptídeo pequeno, com apenas nove resíduos de aminoácidos, com propriedades catiônicas e hidrofóbicas, além de atividade contra bactérias e fungos patogênicos, assim como atividade imuno estimuladora e efeitos sobre a proliferação de células cancerosas, essas características conferem ao peptídeo um caráter de promiscuidade, apesar de não apresentar interação dissulfeto, fazendo deste o primeiro de uma classe ainda pouco conhecida (SILVA et al, 2012) . O peptídeo foi sintetizado usando a técnica de síntese em fase sólida, através da estratégia Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) e a purificação foi feita através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), obtendo um grau de pureza maior que 95%. O Cn-AMP1 constitui uma nova classe de peptídeos, no
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entanto, apresenta atividades semelhantes a outros peptídeos de origem vegetal de classes conhecidas, como as defensinas e ciclotideos, atividades como: a ação inseticida, atividade antimicrobiana e antitumoral. Essas características parecem conferir ao Cn-AMP1 o caráter de promiscuidade, onde são atribuídas múltiplas atividades em condições diferentes ao peptídeo. A causa possível para esse comportamento é a presença do resíduo de arginina na posição cinco, sendo o fator preponderante para a maior atividade antimicrobiana e antitumoral, visto que, tais atividades se baseiam em interações com membranas aniônicas (SILVA et al, 2012). A maior taxa catiônica conferida ao Cn-AMP1, quando comparada aos outros da série, sugere a interação eletrostática entre o peptídeo e componentes de carga negativa, presentes na superfície da membrana celular bacteriana, com os grupos fosfatos dos lipopolissacarideos (LPS) presentes nas bactérias Gram-positivas, ou ainda através de interações hidrofóbicas, no caso de bactérias Gram-negativas (MANDAL et al, 2009). A estrutura tridimensional de biomoléculas em solução, particularmente de proteínas e peptídeos, pode ser elucidada por espectroscopia de Difração de RaiosX e Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H), tal técnica vem se destacando através de experimentos bidimensionais (WÜTHRICH, 1986; CAVANAGH, 1996).

1.3.

Determinação da estrutura 3D de peptídeos

Os dados de estruturas 3D de biomoléculas foram obtidos por muito tempo exclusivamente por difração de Raios-X. A técnica em questão representa um bom meio de se determinar a estrutura tridimensional de moléculas biológicas, no entanto, tal técnica apresenta como inconveniente, a necessidade de se obter monocristais, dificultando o processo. A partir da década de 1980, o

desenvolvimento de equipamentos que geram campos magnéticos de maior intensidade, aliado ao desenvolvimento de novas sequências de pulsos, fizeram da RMN uma ferramenta poderosa na determinação estrutural de biomoléculas, com a vantagem de realizar experimentos na fase líquida, mimetizando o seu ambiente natural. Nesse contexto a RMN, se mostra um eficiente método na determinação estrutural de peptídeos e proteínas, visto que, das 289 estruturas de peptídeos
19

isolados de planta inseridos no The Antimicrobial Peptides Database (APD2), 261 tiveram suas estruturas tridimensionais determinadas por RMN, contra 28 elucidadas por difração de raios-X (WANG, 2009). A ressonância é específica para cada núcleo em estudo, assim atribuições dos sinais são associadas a um resíduo de aminoácido específico na sequência. Os dados fornecidos pela RMN de 1H são então computados seguindo o método denominado, “atribuição sequencial” (WÜTHRICH, 1986). A metodologia foi desenvolvida por Kurt Wüthrich levando em consideração que os experimentos de RMN de
1

H fornecem dados oriundos de três fontes: interações através de escalar, acoplamento dipolar e deslocamentos químicos

acoplamento

característicos. O método de atribuição sequencial para o peptídeo em estudo é esquematizado de forma geral na Figura 7.

Esquema Geral de Atribuição Sequencial para Peptídeos e Proteínas
COSY/TOCSY: Identificação dos sistemas de spins, identificação e classificação dos resíduos de aminoácidos. NOESY: Identificação dos resíduos próximos espacialmente (até 5Å), para análise da conformação tridimensional da molécula.

Atribuição sequencial completa da cadeia peptídica.

Geração e análise das estruturas.

Diagrama de Ramachandran e análise estatística.
Figura 7. Esquema de atribuição sequencial para peptídeos e proteinas. Adaptado de CAVANAGH, 1996.
20

1.4.

Ressonância Magnética Nuclear - RMN

A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica poderosa, que pode ser utilizada na investigação estrutural, dinâmica e cinética química da matéria, seja, nos campos da química orgânica, inorgânica, química de materiais ou biomoléculas. Os primeiros experimentos envolvendo RMN datam da década de 1930, quando Rabi observou experimentalmente o momento magnético do Lítio em 1937, sendo agraciado como o Premio Nobel em 1944 pelo trabalho. Já em 1945, Purcell, Torrey e Pound, observaram próton (1H) em experimento de RMN em parafina. De forma independente e concomitante, Bloch, Hansen e Packard observaram o fenômeno, porém, em água líquida. As descobertas em RMN proporcionaram a Bloch e Purcell, de forma conjunta o Premio Nobel em 1952 (RULE e HITCHENS, 2006). Já no campo das biomoléculas, em 1980, Brown, Bosch e Wüthrich, analisaram a interação do glucagon com micelas através de RMN de
1

H (BROWN, 1980). No ano de 1984, Alexander Arseniev analisou a

conformação do polipeptídio curto insetotoxim, extraído do escorpião (ARSENIEV, 1984). Ainda no campo das biomoléculas Kurt Wüthrich pelos estudos de estruturas e função de macromoléculas biológicas, via RMN, foi agraciado com o Premio Nobel em 2002 (WÜTHRICH, 2003). Dessa forma, o surgimento de novas sequências de pulsos e a construção de equipamentos com campos mais intensos, torna da RMN uma técnica extremamente relevante e versátil em diversos ramos do saber (GIL e GERALDES, 1987). A técnica de RMN se caracteriza pela interação seletiva da radiação com a matéria. Quando uma amostra é submetida a um campo magnético externo B 0 com direção ao longo do eixo z, poderá ocorrer absorção e ou emissão de energia conforme a condição de frequência de Bohr (|ΔE| = ħν), onde, ΔE é a diferença de energia entre os estados fundamental e excitado. O valor de ħ é dado pela relação, ħ = h/2π, sendo h a constante de Planck e ν a frequência de transição. Por ser muito pequena, a energia das transições entre os estados de spin nuclear (I) caem na faixa de radiofrequência (rf). A Figura 8 mostra o espectro eletromagnético, destacada a região de rf (GIL e GERALDES, 1987).

21

Figura 8. Espectro eletromagnético, destacada a região de radiofrequência.

O fenômeno da RMN será percebido somente por núcleos ativos magneticamente, ou seja, aqueles que apresentam momento de spin não nulo (spin I ≠ 0), ao serem submetidos a um campo magnético B 0. Na ausência de B0, esses núcleos se encontram em estados degenerados de energia, apresentando uma distribuição aleatória dos spins. Porém na presença do campo B0, a

degenerescência dos estados é quebrada em níveis quantizados de energia e direção, que obedecem à regra de seleção (2I + 1) da mecânica quântica, sendo esse desdobramento denominado efeito Zeeman. No caso de uma distribuição homogênea de carga (esférica) o núcleo apresenta I = ± 1/2. Nessa condição a distribuição dos spins ocorre em dois diferentes níveis energéticos dados pelo desdobramento Zeeman, e obedecem à distribuição de Boltzman (nα/nβ = e
E/kT

).

Dessa forma, para o caso em que I=1/2, tem-se o estado fundamental, de menor

22

energia (|α> = + 1/2) e o estado excitado de maior energia (|β> = -1/2). Como pode ser observado na Figura 9 (LEVITT, 2008; GIL e GERALDES, 1987).

Figura 9. Efeito Zeeman observado para diferentes núcleos magneticamente ativos na presença de campo magnético B0 na direção z com variações do momento de spin (I). Adaptado de LEVITT, 2008.

Os spins em excesso no estado de menor energia são excitados quando recebe energia de rf, gerada por um campo de natureza oscilante B 1, perpendicular ao campo principal aplicado, de mesma magnitude da frequência de precessão. A frequência específica em que cada núcleo precessa é denominado frequência de Larmor dada por ʋL = B0/2π, onde ʋL é frequência de Larmor,  é a constante magnetogírica e B0 é o campo principal. Quando o campo B1 é desligado os spins excitados entram em um processo de decaimento da energia, denominado, decaimento livre da indução (Free Induction Decay - FID), que é captado por uma bobina no domínio do tempo e submetido a uma Transformada de Fourier (TF), dando a forma ao sinal de RMN no domínio das frequências (GIL e GERALDES,
1987). A constante magnetogírica  é característica de cada núcleo, e se relaciona

diretamente à sensibilidade, assim núcleos com valores maiores desse fator se caracterizam como melhores sondas de RMN, como podem ser observadas na Tabela 7.

23

Tabela 7. Sensibilidade relativa e constante magnetogírica de alguns núcleos usados como sondas RMN. Núcleo
1 2

Sensibilidade relativa 1,0 0,0096 0,016 0,093 0,066 0,830

Constante magnetogírica (107 rad T-1 s-1) 26,7520 4,1066 6,7283 7,0801 10,841 25,181

H H C

13 23

Na P F

31

19

1.4.1. Deslocamento químico

Os núcleos com I ≠ 0 apresentam um momento magnético associado aos elétrons presentes na molécula, a distribuição dos elétrons na molécula dá origem a um campo local Bloc. O movimento desses elétrons gera em torno de cada núcleo um campo magnético, denominado Bloc, esse campo pode se orienta a favor ou contra o campo magnético principal B0 reduzindo ou aumentando sua intensidade. O campo local sofre interferência do efeito indutivo, da anisotropia ou ressonância, assim como da delocalização eletrônica (hibridização) e repulsão eletrônica. A anisotropia afeta Bloc sempre que o núcleo em estudo se encontra nas proximidades de um centro onde há circulação de elétrons, como carbonila, ligação tripla ou grupo aromático. O anel aromático promove uma blindagem diferenciada, conforme a orientação com relação ao campo principal. A magnitude do campo local B loc é proporcional a B0, e tem influência direta na frequência de absorção do spin nuclear. No entanto o campo Bloc se diferencia de B0 por força da densidade eletrônica e do movimento de precessão dos elétrons do meio onde o núcleo está inserido (GIL e
GERALDES, 1987). O Bloc pode ser determinado pela equação 1.

Bloc = (1 - σ)B0 Onde σ é a blindagem do spin nuclear.

(1)

24

O fator σ é denominado constante de blindagem, quando se tratar de uma distribuição eletrônica isotrópica da molécula. Se o campo Bloc estiver na direção do campo externo, o núcleo sentirá um campo mais intenso, sendo atribuído um efeito de desblindagem e passará a precessar em frequências maiores. Caso o campo B loc seja contrário ao sentido de B0 o campo percebido pelo núcleo será inferior, levando a um efeito de blindagem, deslocando a frequência de precessão do núcleo para valores menores. A frequência de ressonância é sensível ao ambiente químico do spin nuclear. Tal efeito induz flutuações do campo sentido pelo núcleo, essas variações são denominadas deslocamentos químicos (Equação 2). O deslocamento químico pode ser calculado pela Equação 2. δ(ppm) = [(ν – νref) / νref]106

(2)

Sendo δ o deslocamento químico em ppm, ν é a frequência do núcleo e νref, a frequência do composto de referência. O deslocamento químico e medido geralmente em relação a um padrão de RMN, como: o TMS (tetrametilsilano), o DSS (ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1sulfônico) e o TMSP (sódio-3-trimetilsililpropionato), esses compostos servem como referência para o deslocamento químico de núcleos como: Si, C e H, devido à blindagem máxima dos hidrogênios metílicos que apresentam. A estrutura dos principais padrões de referência utilizados em RMN é mostrada na Figura 10.

TMS

DSS

TMSP

Figura 10. Representação da estrutura química dos principais padrões de referência utilizados em RMN.

25

1.4.2. Espectroscopia de RMN bidimensional

A espectroscopia de correlação bidimensional (2D) foi sugerida pelo físico belga Jean Jeener em 1971. A técnica consiste de quatro etapas: preparação, evolução indireta (t1), mistura e detecção (t2), conforme mostrado na Figura 11.

Figura 11. Geração de um espectro bidimensional. Adaptado de (RULE e HITCHENS, 2006).

O uso dessa metodologia simplifica espectros constituídos de muitos picos sobrepostos, através da separação dos picos sobre uma segunda dimensão. Obtendo desta forma uma melhor resolução espectral, o que permite identificar interações inter e intramoleculares usando correlação seletiva dos picos (PEREIRA e PASQUINI, 2006). O uso da RMN 2D para determinação da estrutura tridimensional de macromoléculas biológicas, como proteínas e peptídeos, tem um papel fundamental na busca pela compreensão da dinâmica, estabilidade e ação das substâncias. Isso pode ser feito através de experimentos de correlação homonuclear como: Homonuclear Correlation Spectroscopy (COSY 2D), Tottal Correlation Spectroscopy (TOCSY 2D), Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy (NOESY 2D) e Rotating frame Overhauser Enhancement Spectroscopy (ROESY 2D). O COSY permite a identificação dos hidrogênios acoplados escalarmente
2-3

JH-H (por meio da
26

ligação) de forma intrarresidual (no mesmo resíduo), permitindo estabelecer os deslocamentos químicos e o sistema de spins característico de cada resíduo. A identificação do resíduo é feita através da comparação com os valores de deslocamento químico dos 20 aminoácidos em estrutura randômica, pH 7,0 e 35ºC (WÜTHRICH, 1986), apresentados na Tabela 5. A Figura 12 mostra as regiões características de deslocamento químico de uma amostra de peptídeo, proteína ou ácidos nucleicos, em um experimento de COSY, (RULE e HITCHENS, 2006).

Figura 12. Mapa de correlação COSY 2D, identificando as regiões contendo picos cruzados, adaptado de CAVANAGH 1996.

O experimento de TOCSY envolve a condição Homonuclear de HartmannHahn (HOHAHA), onde hidrogênios não necessariamente acoplados são

detectados, desde que tenham um hidrogênio vizinho comum que realize acoplamento com ambos. O TOCSY é semelhante ao experimento de COSY, onde, durante o período de mistura (mixing time), aqui denominado spinlock, a magnetização permanece no eixo y transferindo a magnetização coerente de um spin a outro na molécula via ligação. O uso de tempos de mistura maiores permite
27

que a magnetização seja transferida para além dos spins diretamente acoplados, tornando possível analisar sistemas separados por carbono sem hidrogênio ou heteroátomo dentro da mesma molécula, até 7J, no caso de peptídeos e proteínas (SILVERSTEIN, 2006). Como os resíduos de aminoácidos apresentam diferentes tipos de cadeia lateral, as quais têm uma grande quantidade e variedade de núcleos de hidrogênio. Esse fato é de grande importância para os experimentos de RMN, visto que esse núcleo tem características ideais de abundância e spin, o que o torna uma ótima sonda de detecção de RMN. Contudo a alta densidade de núcleos H em biomoléculas provoca uma elevada dispersão dos sinais de RMN. A identificação e classificação das redes individuais de sistemas de spin constitui uma medida importante para alcançar a atribuição específica de cada resíduo da cadeia peptídica. Os prótons pertencentes a um único resíduo de aminoácido constituem uma rede distinta de acoplamento escalar, que pode ser identificada através de experimentos bidimensionais, tais como COSY 2D e TOCSY 2D. A rede de sistema de spin de cada resíduo representa um padrão especifico, dentro dos mapas de correlação nos experimentos, sendo para o TOCSY, conhecido como padrão de TOCSY (Figura 13), e são fundamentais na atribuição de peptídeos (CHARY e GOVIL, 2008). Os padrões de deslocamento observados para os 20 resíduos de aminoácidos podem ser observados no ANEXO 1B.

Figura 13. Padrão de TOCSY do resíduo de aminoácido glutamina (Gln), adaptado de WÜTHRICH, 1986.
28

A análise do mapa de contorno de TOCSY 2D permite obter informação sobre os núcleos, inclusive os mais distantes da cadeia lateral, podendo assim caracterizar toda a rede de sistemas de spin e identificar os tipos de resíduo em uma única linha de ressonância, como mostrado na Tabela 8 (WÜTHRICH, 1986). Tabela 8. Deslocamento químico dos 20 resíduos de aminoácidos em estrutura randômica, em pH 7,0 e 35ºC, adaptado de WÜTHRICH, (1986). Resíduo Gly Ala Val Ile HN 8,39 8,25 8,44 8,19 Hα 3,97 4,35 4,18 4,23 1,39 2,13 1,90 Hβ Outros -

CH3 0,97; 0,94 CH2 1,48; 1,19 CH3 0,95; δCH3 0,89 H 1,64; δCH3 0,94; 0,90 CH2 2,03; 2,03; δCH2 3,68; 3,65
-

Leu Prob Ser Thr Asp Glu Lys

8,42 8,38 8,24 8,41 8,37 8,41

4,38 4,44 4,50 4,35 4,76 4,29 4,36

1,65; 1,65 2,28; 2,02 3,88; 3,88 4,22 2,84; 2,75 2,09; 1,97 1,85; 1,76

CH3 1,23
-

CH2 2,31; 2,28 CH2 1,45; 1,45; δCH2 1,70; 1,70
εCH2 3,02; 3,02; εNH3+ 7,52

Arg

8,27

4,38

1,89; 1,79

CH2 1,70; 1,70; δCH2 3,32; 3,32
NH 7,17; 6,62

Asn Gln Met Cys Trp

8,75 8,41 8,42 8,31 8,09

4,75 4,37 4,52 4,69 4,70

2,83; 2,75 2,13; 2,01 2,15; 2,01 3,28; 2,96 3,32; 3,19

NH2 7,59; 6,91 CH2 2,38; 2,38; δNH2 6,87; 7,59 CH2 2,64; 2,64; εCH3 2,13
2H 6H 7,24; 4H 7,24; 7H 7,65; 5H 7,17

7,50; NH 10,22 7,34

Phe Tyr His

8,23 8,18 8,41

4,66 4,60 4,63

3,22; 2,99 3,13; 2,92 3,26; 3,20

2,6H 7,30; 3,5H 7,39; 4H 2,6H 7,15; 3,5H 6,86 2H 8,12; 4H 7,14

29

1.4.3. Efeito nuclear Overhauser - nOe O Efeito nuclear Overhauser, nOe é resultado de interações magnéticas decorrentes de acoplamentos dipolares de núcleos próximos espacialmente. A intensificação do sinal de um núcleo I é promovida pela relaxação de um núcleo S, acoplado dipolarmente a I. O núcleo S é irradiado de forma contínua até o estado de saturação. Ao atingir a saturação o núcleo S torna susceptível a transições proibidas do tipo Double quantum (W2) e Zero quantum (W0), transferindo magnetização ao núcleo I, via um processo de relaxação cruzada. O efeito nOe decorre de interações em um sistema de dois spins (I e S) em diferentes estados quânticos (αα, αβ, βα, ββ), com possibilidade de transições entre eles. Para moléculas pequenas tem-se um efeito nOe positivo, no entanto para moléculas grandes, esse efeito é negativo. Nas moléculas pequenas, onde o tempo de correlação tc é pequeno, a relaxação cruzada ζIS depende das transições tipo Double quantum (W2). Já nas moléculas grandes o mecanismo Zero quantum (W0) prevalece. O tempo de correlação tc, define o tempo necessário, para que a molécula realize uma volta completa em torno do seu eixo. Dessa forma as moléculas grandes que apresentam tc longo, relaxam por outras vias além da dipolar, reduzindo a eficiência do efeito nOe. A eficiência do efeito nOe depende da relaxação cruzada entre os núcleos, seu efeito é calculado segundo a Equação 5. Os experimentos de NOESY permitem estabelecer à configuração relativa de cada hidrogênio e assim inferir sobre a geometria molecular. A medida do efeito nOe é definida pelo fator η dado pelas Equações 3 e 4 (Claridge, 2009). η = fI {S} = (I – I0) /I0 fI {S} = (S ζIS) / (I ρIS) (3) (4)

Onde I e I0 são as intensidades da ressonância com e sem irradiação do spin S, e ζIS é a relaxação cruzada dada pela equação 5: ζIS = W2 – W0 Onde: W2 são transições Double quantum e W0 são transições Zero quantum. O fator ρIS representa a relaxação dipolar entre o spin I e S, com uma (5)

eficiência dependente da distância entre os núcleos e do movimento molecular quando em solução (Claridge, 2009), dado pela equação 6:
30

η = f(tc rij -6)

(6)

Onde, η é o fator que mede o efeito nOe, f(tc) é um fator relacionado aos movimentos moleculares (internos e globais) e r-6 é o inverso da distância relativa entre os núcleos. O experimento de NOESY representa uma valiosa fonte de informações quanto à geometria molecular e a conformação da cadeia peptídica, visto que, a intensidade ou volume do sinal de nOe se relaciona com a distância média relativa entre os núcleos, permitindo analisar a conformação espacial da cadeia peptídica. Esta relação é caracterizada pela equação 7. V= (rij -6) f(tc) (7)

As correlações de nOe localizados nos resíduos de posições i e j dados pela notação dAB (i, j), são definidos a partir da direção N-terminal para C-terminal da cadeia peptídica, como pode ser observado na Figura 14 (Claridge, 2009).

V
CH3 CH3

A

Ni H

C

CH i

O Ci dN Ni+1 H

C

CH3 i+1

O Ci+1 dN

H
dNN

H
dNN

Figura 14. Principais correlações ou interações dipolares de núcleos de 1H entre resíduos de aminoácidos próximos entre si na sequência peptídica (WÜTHRICH, 2003).

2.

Objetivo

O presente trabalho teve como objetivo determinar e analisar a estrutura tridimensional do peptídeo Cn-APM1, isolado da água de coco verde (Cocos Nucífera), por RMN em solução.
31

3.

Material e Métodos O trabalho foi todo desenvolvido no Laboratório de RMN do Instituto de

Química da Universidade Federal de Goiás, utilizando um aparelho Bruker Avance III de 11,75 T, apresentado na Figura 15, com blindagem lateral do campo, operando a frequência de 500,13 MHz para o núcleo de hidrogênio e sonda de detecção inversa de três canais 1H,
13

C e XBB, Triple Resonance broadband Inverse probehead (TBI-

Z) para análises de amostras em tubos com 5 mm de diâmetro, equipada com gradiente em z máximo de 55 Gauss/cm, operando na faixa de temperatura de -150 ºC a +180 ºC com precisão de 0,1 ºC. Os experimentos foram coletados usando o software Topspin 2.1 desenvolvido pela Bruker BioSpin.

Figura 15. Espectrômetro Bruker Avance III 500 MHz do Lab. RMN do IQ-UFG.

3.1.

Preparo da Amostra

A massa equivalente a 1mg da amostra do peptídeo Cn-AMP1, já liofilizada, foi cedida pelo Prof. Dr. Octávio Luiz Franco do Centro de Análises Proteômicas e Bioquímicas da Universidade Católica de Brasília. Para análise por RMN, o pH de uma fração de H2O deionizada foi ajustado para 3,97 pela adição de HCl, visando
32

manter protegidas as porções C-terminal e N-terminal, evitando-se assim a auto associação do peptídeo. Foram tomadas duas alíquotas de 250 μL. Na primeira alíquota foi adicionado 17,60 mg de dodessilsulfato de sódio (SDS-d25) 98% de pureza, aguardando-se 30 minutos, para formação de micelas e mimetização da membrana celular. Na segunda fração, adicionou-se 0,47 mg do peptídeo. Finalmente, as duas alíquotas foram agrupadas e adicionado 50 μL de solução D2O e TMSP-d4 (99:1, v/v) do Cambridge Isotope Laboratories, perfazendo um total de 550 μL, numa concentração de peptídeo de 1 mM e 100 mM de SDS -d25. Em seguida foi preparada também uma solução do peptídeo nas mesmas condições citadas anteriormente, porém variando com a adição de tampão PBS e também, sem a adição de SDS-d25. Em seguida, a solução formada foi inserida em um tubo de RMN de 5 mm, utilizando uma pipeta pasteur. O tubo foi inserido em um rotor e em seguida aferido o nível com o uso de um suporte para garantir que a solução se encontre na região de alcance da bobina de excitação/detecção. A Figura 16 mostra os materiais usados no preparo da amostra.

Figura 16. Materiais utilizados nos experimentos de RMN do peptídeo Cn-AMP1: a) suporte, onde o nível central indica a região de cobertura da bobina de excitação/detecção; b) rotor; c) tubo de RMN.
33

3.2.

Aquisição dos mapas de correlação de RMN 2D

Após a inserção da amostra no magneto foi feita a sintonia para o núcleo de
1

H através do ajuste da frequência (Tunning) e da intensidade (Matching). Em

seguida, após a seleção do solvente (90% H2O e 10% D2O), o campo foi então travado no solvente de trabalho (lock). O experimento de 1H foi criado e escolhido o número de varreduras (scans), em seguida ajustado a janela espectral para 16 ppm, procedendo em seguida ao ajuste automático da homogeneidade do campo magnético, através dos comandos topshim 3D e topshim e o cálculo do ganho do receptor (rga). Ao final foi feita a aquisição de um espectro de RMN de 1H usando a sequência zg30 com apenas 1 scan, com o intuito de marcar a frequência a ser irradiada, para a supressão do sinal da água (o1). Outro experimento foi criado, considerando-se o valor determinado para o1, e efetuada a pressaturação do sinal nesta região através da sequência zgcppr para supressão do sinal da água. Foram realizadas 8 varreduras, com uma janela espectral de 16 ppm, aquisição em quadratura (DQD), com número de pontos (TD) de 64 k para o FID, tempo de aquisição (AQ) de 4 s e tempo de espera (D1) de 1 s. Foram realizados experimentos de correlação bidimensional de Totally Correlation Spectroscopy (TOCSY) e Nuclear Overhauser Enhancement

Spectroscopy (NOESY). Em todos os experimentos a temperatura foi mantida em 25ºC. O experimento de COSY foi adquirido utilizando a sequência cosyphpr com pressaturação do sinal da água, com modo de aquisição DQD na dimensão direta (f2) e States na dimensão indireta (f1), com TD de 4 k em f2 e 256 scans em f1. Foram realizadas 184 varreduras, com 16 varreduras de espera (dummy scans – DS), janela espectral de 16 ppm, tempos de aquisição de 0,26 s em f2 e 0,01 s em f1. O ganho do receptor de 25,4 e frequência de offset em 2343,61 Hz em ambas as dimensões, o pulso de 90º (p1) foi de 8,33 s, uma atenuação (pl9) de 52,00 dB e tempo de espera (DE) de 6,50 μs. O experimento de TOCSY foi adquirido utilizando a sequência dipsi2esgpph (SHAKA, 1988; HWANG, 1995), com modo de aquisição DQD na dimensão direta (f2) e States-TPPI na dimensão indireta (f1), com TD de 4 k em f2 e 256 scans em f1. Foram realizadas 184 varreduras, com 16 varreduras de espera ( dummy scans –
34

DS), janela espectral de 16 ppm, tempos de aquisição de 0,26 s em f2 e 0,01 s em f1, tempo de mistura (d9) de 80 ms. O ganho do receptor de 1620 e frequência de offset em 2343,61 Hz em ambas as dimensões, o pulso de 90º (p1) foi de 8,33 s, uma atenuação (pl9) de 52,00 dB e tempo de espera (DE) de 10,0 μs. O experimento de NOESY foi adquirido utilizando a sequência noesygpph19 (PIOTTO, 1992; SKLENAR, 1993), com modo de aquisição DQD na dimensão direta (f2) e States na dimensão indireta (f1), com TD de 4 k em f2 e 512 scans em f1, 104 varreduras, com DS de 16 varreduras, janela espectral de 16 ppm, tempos de aquisição de 0,26 s em f2 e 0,03 s em f1, tempo de mistura (d8) foi otimizado para 200 ms evitando assim o aparecimento de sinais decorrentes de difusão. O ganho do receptor foi de 1k e frequência de offset em 2343,61 Hz em ambas as dimensões, o pulso de 90º (p1) foi de 8,33 μs, uma atenuação (pl9) de 52,00 dB e tempo de espera (DE) de 6,50 μs.

3.2.1. Processamento dos dados de RMN

Os experimentos de TOCSY e NOESY foram processados utilizando os pacotes do programa NMRPipe (DELAGLIO et al., 1995), e convertidos no formato do NMRView (JOHNSON e BLEVINS, 1994) para análise dos dados. As estruturas foram calculadas utilizando XPLOR-NIH (SCHWIETERS, 2003; 2006). A análise estrutural foi realizada utilizando o PROCHECK (LASKOWSKI, 1996) e as estruturas foram visualizadas utilizando o software PyMOL, versão 1.2r1 (DELANO, 2002). As funções de processamento são apresentadas na Figura 17A e 17B.

35

A) #!/bin/csh # # 2D States-Mode HN-Detected Processing. nmrPipe -in test.fid \ #| nmrPipe -fn SOL \ | nmrPipe -fn GM -g1 5.0 -g2 10.0 -g3 0.0 -c 1.0 \ \ | nmrPipe -fn ZF -auto \ | nmrPipe -fn FT -auto \ | nmrPipe -fn PS -p0 -93.4 -p1 -7.6 -di \ #| nmrPipe -fn EXT -left -sw \ | nmrPipe -fn TP \ #| nmrPipe -fn LP -fb -ord 10 -pred 1024 \ | nmrPipe -fn SP -off 0.5 -end 0.98 -pow 1 -c 1.0 \ | nmrPipe -fn ZF -auto \ | nmrPipe -fn FT -auto \ | nmrPipe -fn PS -p0 -84.9 -p1 179.4 -di \ #| nmrPipe -fn REV \ #| nmrPipe -fn BASE -nw 2 -nl 0% 5% 95% 100% \ #| nmrPipe -fn MED -nw 24 \ | nmrPipe -fn POLY -auto \ | nmrPipe -fn TP \ #| nmrPipe -fn POLY -auto \ | nmrPipe -fn POLY -auto -xn 12.0ppm -x1 5.5ppm \ | pipe2xyz -nv -out mabio_tocsy.nv

B) #!/bin/csh # # 2D States-Mode HN-Detected Processing. nmrPipe -in test.fid \ #| nmrPipe -fn SOL \ | nmrPipe -fn GM -g1 5.0 -g2 10.0 -g3 0.0 -c 1.0 \ \ | nmrPipe -fn ZF -auto \ | nmrPipe -fn FT -auto \ | nmrPipe -fn PS -p0 -73.2 -p1 -55.4 -di \ #| nmrPipe -fn EXT -left -sw \ | nmrPipe -fn TP \ #| nmrPipe -fn LP -fb -ord 10 -pred 1024 \ | nmrPipe -fn SP -off 0.5 -end 0.98 -pow 1 -c 1.0 \ | nmrPipe -fn ZF -auto \ | nmrPipe -fn FT -auto \ | nmrPipe -fn PS -p0 -83.3 -p1 173.2 -di \ #| nmrPipe -fn REV \ #| nmrPipe -fn BASE -nw 2 -nl 0% 5% 95% 100% \ #| nmrPipe -fn MED -nw 24 \ | nmrPipe -fn POLY -auto \ | nmrPipe -fn TP \ #| nmrPipe -fn POLY -auto \ | nmrPipe -fn POLY -auto -xn 12.0ppm -x1 5.5ppm \ | pipe2xyz -nv -out mabio_noesy.nv

Figura 17. Protocolos de processamento dos mapas de contorno do peptídeo CnAMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 Mm, pH 3,97 e 25 ºC realizado utilizando o software NMRPipe (DELAGLIO et al., 1995), sendo : A) NOESY 2D; B) TOCSY 2D.

3.3.

Cálculo, geração e análise das estruturas 3D

As intensidades dos picos cruzados de nOe foram convertidas em 118 restrições de distância, não havendo restrições de longa distância. O cálculo das estruturas foi realizado usando o programa XPLOR-NIH (SCHWIETERS et al., 2006) versão 2.28, empregando o método de minimização de energia semi-empírico, simulated annealing (S.A.) (SCHWIETERS et al., 2003) ou recozimento simulado. O processo transcorre partindo de uma estrutura gerada de forma aleatória (randômica), onde é feita uma simulação de aquecimento rápido, visando ultrapassar todas as barreiras conformacionais da molécula, seguido de um resfriamento lento para que esta se organize em uma estrutura conformacional de menor energia global possível.
36

A anfipaticidade da porção em hélice do peptídeo foi avaliada submetendo a sequência primária deste, ao cálculo usando o aplicativo HydroMCalc, disponível no site http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/HydroCalc/HydroMCalc.html#run, com

escala hidrofobicidade consenso combinada (CCS) (TOSSI, 2002).

4. Resultados e Discussão 4.1. Análise do TOCSY 2D

4.1.1. Peptídeo Cn-AMP1 sem micelas de SDS-d25

A estruturação do peptídeo decorre da interação com a micela formada pelo SDS. Dessa forma foram realizados experimentos de TOCSY e NOESY, na ausência de SDS-d25. A região de correlações HN-Hα do mapa de contornos de TOCSY é expandida e apresentada na Figura 18.

Figura 18. Identificação dos resíduos e cadeia lateral no TOCSY para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM sem adição de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC.

37

A análise do TOCSY permitiu atribuir e identificar os sinais devido às interações intramoleculares. A identificação dos resíduos de aminoácido é feita considerando as informações obtidas da análise dos experimentos de COSY e TOCSY, visto que, tais experimentos fornecem dados de interação escalar dos hidrogênios contidos em um mesmo resíduo. Os valores de deslocamento químico para cada resíduo são então comparados aos valores de referência contidos na Tabela 8, dessa forma são identificados os sistemas de spins para cada resíduo e para toda cadeia peptídica conforme apresentados na Tabela 9.

Tabela 9. Deslocamento químico observado para os resíduos de aminoácidos da cadeia peptídica do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH 3,97 e 25 ºC sem micelas de SDS-d25. Resíduo Ser-1 Val-2 Ala-3 Gly-4 Arg-5 Ala-6 Gln-7 Gly-8 Met-9 HN Hα Hβ 3,88 2,00 1,33 1,73 1,33 2,00 2,07 Outros 0,92(γCH3), 0,87(γCH3) 1,68(βH1), 1,56(γCH2), 3,13(δCH2), 7,16(εNH) 1,96(βH1), 2,33(γH) 1,92(βH1), 2,45(γH) Padrão de deslocamento A3B3MX A3X AX A2(T2)MPX A3X AM(PT)X AX AM(PT)X

8,56 4,13 8,48 4,25 8,35 3,88 8,11 4,29 8,40 4,25 8.36 4,22 8,44 3,88 7,86 4,31

Os resultados foram submetidos ao Índice de Deslocamento Químico (Chemical Shift Index – CSI), que a partir de valores experimentais de deslocamento químico de Hα comparados com os valores teóricos, fornece de forma rápida e de forma simples a tendência de estruturação da molécula. A variação do CSI obedece à relação ∆δ = δob – δref, onde ∆δ é a variação do deslocamento químico com relação ao referencial teórico. Onde δob é o valor de deslocamento químico observado para o resíduo em estudo, e δref é o deslocamento químico de referência mostrado na Tabela 10. Os valores teóricos de deslocamento químico foram obtidos a partir do estudo de doze proteínas, sem introdução de correções de pH ou
38

temperatura. Os valores de ∆δ indicam a tendência do peptídeo se estruturar em αhélice, β-folha ou randômica. A tendência de estruturação em α-hélice é definida quando se obtém uma sequência de quatro ou mais valores negativos de ∆δ, não interrompidos por valores positivos de ∆δ. A estrutura β-folha é indicada quando se observa três ou mais valores positivos de ∆δ, não interrompidos por valores negativos de ∆δ. As demais situações são consideradas estruturas randômicas (WISHART et al, 1991, 2011).

Tabela 10. Deslocamento químico observado para os 20 resíduos de aminoácidos na forma randômica. Adaptado de WISHART et al, 1992. Resíduo Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu δ 1Hα (ppm) 4,35±0,10 Resíduo Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Try δ 1Hα (ppm) 4,52±0,10

4,65±0,10 4,76±0,10 4,29±0,10 4,66±0,10 3,97±0,10 4,63±0,10 3,95±0,10 4,36±0,10 4,17±0,10

4,75±0,10 4,44±0,10 4,37±0,10 4,38±0,10 4,50±0,10 4,35±0,10 3,95±0,10 4,70±0,10 4,60±0,10

39

Os valores de deslocamento foram submetidos ao cálculo de CSI, os quais são mostrados graficamente na Figura 19.

Figura 19. Índice de deslocamento químico para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH 3,97 e 25 ºC sem micelas de SDS-d25.

Os deslocamentos químicos obtidos para o peptídeo em solução, na ausência de SDS-d25 apresentaram-se em acordo com os valores médios para cada resíduo, mostrados na Tabela 5. Nesse experimento não foi observado o sinal de H α para o resíduo Ser-1, devido a sua mobilidade e troca com o solvente. As informações extraídas do gráfico de CSI indicam que o peptídeo não apresenta tendência de estruturação em hélice na ausência de SDS-d25, caracterizado por valores negativos não sequenciais de ∆CSI, e por apresentar um desvio positivo para Val-2 com relação ao referencial teórico, além dos valores zero apresentado pelos resíduos Gly-4, Arg-5 e Gly-8, indicando uma conformação randômica.

4.1.2. Peptídeo Cn-AMP1 sem micelas de SDS-d25 em tampão PBS e pH fisiológico

O mapa de correlação de TOCSY em pH fisiológico, sem adição de SDS-d25 apresentou sinais bem resolvidos, o que permitiu identificar e atribuir todos os resíduos, conforme apresentado na Figura 20.
40

Figura 20. Identificação dos resíduos e cadeia lateral no TOCSY para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM sem micelas de SDS-d25, 100 mM, em tampão PBS, pH fisiológico e 25 ºC.

Os deslocamentos químicos obtidos para o peptídeo em solução, na ausência de SDS-d25 e pH fisiológico apresentaram-se em acordo com os valores médios para cada resíduo, mostrados na Tabela 8. Nesse experimento também não foi observado o sinal de Hα para o resíduo Ser-1, devido a sua mobilidade e troca com o solvente. Os valores de deslocamento obtidos são mostrados na Tabela 12.

41

Tabela 12. Deslocamento químico observado para os resíduos de aminoácidos da cadeia peptídica do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, em tampão PBS, pH fisiológico e 25ºC, sem micelas de SDS-d25. Resíduo Ser-1 Val-2 Ala-3 Gly-4 Arg-5 Ala-6 Gln-7 Gly-8 Met-9 HN Hα Hβ 2,08 1,40 1,80 1,43 2,00 2,01 Outros 0,95(γCH3) 1,63(βH1), 3,21(δCH2), 7,19(εNH) 2.12(βH1), 2,59(γH) 2,13(βH1), 2,59(γH) Padrão de deslocamento A3B3MX A3X AX A2(T2)MPX A3X AM(PT)X AX AM(PT)X

8,43 4,31 8,53 4,31 8,41 3,94 8,19 4,37 8,46 4,31 8.27 4,49 8,45 3,97 8,25 4,48

Os deslocamentos químicos obtidos do TOCSY na condição de pH fisiológico e sem a presença de micelas de SDS-d25, foram submetidos ao cálculo de CSI, e os valores são mostrados graficamente na Figura 21.

Figura 21. Índice de deslocamento químico para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, em tampão PBS, pH fisiológico e 25 ºC sem micelas de SDS-d25.

42

As informações extraídas do gráfico de CSI indicam que o peptídeo não apresenta tendência de estruturação em hélice na ausência de SDS-d25, e pH fisiológico caracterizado pela presença de valores positivos e ausência de valores negativos de ∆CSI, os resíduos de Val-2 e Met-9 apresentaram considerável variação de deslocamento químico em relação às outras condições e ao referencial teórico, indicando uma conformação randômica.

4.1.3. Peptídeo Cn-AMP1 com micelas de SDS-d25

Os experimentos de COSY e TOCSY apresentaram sinais bem resolvidos e de boa intensidade, o que possibilitou identificar os acoplamentos escalares a três (3J) ligações através do COSY. Esses dados dão indícios de um alto grau de estruturação do peptídeo, o que pode ser comprovado pela maior dispersão dos sinais dos hidrogênios amídicos nos espectros de 1D de RMN de 1H, na condição sem SDS. Como é mostrado na Figura 22.

Figura 22. Expansão dos espectros 1D de RMN de 1H, na região amídica do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH 3,97 e 25 ºC. A) Com micelas de SDS-d25, 100 mM; B) Sem micelas de SDS-d25.

As atribuições foram confirmadas no mapa de correlações de TOCSY, que através da transferência de magnetização via spinlock permitiram identificar os deslocamentos químicos de cadeia lateral e atribuir às correlações intraresiduais de todos os resíduos de aminoácidos. Essas interações são de grande importância para

43

a atribuição de todos os sinais dos mapas de correlação e para a identificação dos sistemas de spins de cada resíduo, através da atribuição dos sinais de cadeia lateral. No entanto, esse tipo de interação fornece pouca informação a cerca da estrutura tridimensional. Nas Figuras 23A e 23B são destacadas as ampliações da região referente aos acoplamentos de HN-Hα do mapa de correlação COSY e TOCSY. (A)

(B)

Figura 23. Expansão da região de HN-Hα e cadeia lateral do COSY (A) e TOCSY (B), do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM em micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25ºC, as linhas verticais mostram as correlações de cadeia lateral de cada resíduo.
44

A atribuição dos sinais foi feita usando o mapa de correlação de COSY, onde se observa os acoplamentos escalares à no máximo três ligações ( 3J) e confirmadas pelo TOCSY, identificando primeiramente as correlações do sinal de H N-Hα, com a correspondente cadeia lateral de cada resíduo na vertical, como mostrado na Figura 23. Em seguida, essa atribuição foi confirmada através da identificação dos sistemas de spins de cada resíduo, conforme apresentado na Figura 24.

Figura 24. Identificação do sistema de spin em ordem de atribuição dos sinais no mapa de correlação TOCSY para a Val-2 do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, pH 3,97 e 25 ºC.

Os valores experimentais de deslocamento químico dos sinais de COSY e TOCSY foram comparados com os deslocamentos químicos dos 20 aminoácidos essenciais (Tabela 8). Essa análise é essencial para a identificação dos sistemas de spins de cada resíduo de aminoácido da sequência, conforme mostrado na Tabela 13. Todos os sistemas de spins tem o padrão de deslocamento mostrado no ANEXO 1B.

45

Tabela 13. Deslocamento químico observado para os resíduos de aminoácidos do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. Resíduo HN Hα Hβ Outros 4,06(γH) 1,03(γCH3), 0,96(γCH3) 1,91(βH1), 1,71(γCH2), 3,18(δCH2), 7,16(εNH) 2,15(βH1), 2,41(γH) 2,09(βH1), 2,54(γH) Padrão de deslocamento AMX A3B3MX A3X AX A2(T2)MPX A3X AM(PT)X AX AM(PT)X

Ser-1 Val-2 Ala-3 Gly-4 Arg-5 Ala-6 Gln-7 Gly-8 Met-9

-

4,33

4,27 2,17 1,39 1,72 1,43 2,03 1,99

8,64 3,95 8,23 4,16 8,09 3,89 7,95 4,22 8,15 4,24 7,92 4,25 8,14 3,96 7,79 4,27

O cálculo de CSI para o peptídeo em estudo com micelas de SDS é representado graficamente na Figura 25.

. Figura 25. Índice de deslocamento químico para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC.

A análise dos dados de CSI indica uma tendência do peptídeo de se estruturar em hélice em toda sua extensão, devido ao predomínio de valores
46

negativos em sequência. Destaca-se que a presença de valor zero para Val-2, Gly-4 e Gly-8, não descaracteriza a tendência de formação de hélice, já que seria necessário pelo menos um valor positivo ou uma sequência de valores zero para tal. Os valores de CSI da Val-2, Gly-4 e Gly-8, apresentaram valores negativos menores que 0,1 ppm, ficando abaixo do erro conferido para os valores teóricos, dessa forma com a codificação para esses valores foi atribuído zero (WISHART et al, 1991, 2011).

4.1.4. Peptídeo Cn-AMP1 com micelas de SDS-d25 em tampão PBS e pH fisiológico

A estruturação do peptídeo também foi avaliada em pH fisiológico, ajustado com o uso de tampão fosfato-salino (phosphate buffered saline – PBS), visto ser este o ambiente natural onde essas moléculas se encontram, para isso foram realizados experimentos de correlação homonuclear, TOCSY 2D e NOESY 2D, mantendo-se as condições de temperatura e em presença de SDS. Os experimentos de correlação foram processados obedecendo aos protocolos citados anteriormente, assim como os procedimentos de identificação dos deslocamentos químicos e sistemas de spins, seguiram os protocolos já referenciados. Os sinais de interação intramolecular foram todos devidamente identificados e atribuídos, assim como os sistemas de spins individuais de cada resíduo. O mapa de correlações TOCSY do peptídeo em pH fisiológico apresentou sinais bem resolvidos, e com boa intensidade, a exceção ficou com o sinal da Val-2, que se mostrou de pouca intensidade e variação do deslocamento químico quando comparado com o deslocamento apresentado no experimento em meio ácido, não sendo possível a observação dos sinais de cadeia lateral na região de interação HNHα do mapa de TOCSY. Na Figura 26 é mostrada a expansão da região de acoplamentos H N-Hα do mapa de correlações TOCSY.

47

Figura 26. Identificação dos resíduos e cadeia lateral no TOCSY para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com adição de SDS-d25, 100 mM, pH fisiológico em tampão PBS e 25 ºC.

A análise da região de cadeia lateral proporcionou a identificação e atribuição dos sinais da Val-2, que apresenta o sistema de spins A3B3MX, característico de tal resíduo, o qual pode ser devidamente identificado, visto que este o resíduo é o único presente no peptídeo a apresentar tal padrão. Dessa forma, o resíduo de Val-2 teve sua atribuição e identificação confirmada, como pode se observado na Figura 27. Outra observação importante foi a identificação do resíduo de Ser-1, que em condições de pH ácido, não foi detectada, sugerindo uma interação que restringe a velocidade de troca com o solvente em condição neutra o peptídeo, devido a falta de dinâmica do resíduo.

48

Figura 27. Identificação do sistema de spins no TOCSY da Val-2 para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, com micelas de SDS-d25, 100mM, em tampão PBS pH fisiológico e 25 ºC.

A análise do experimento de TOCSY permitiu obter os deslocamentos químicos para o peptídeo em pH fisiológico. Os dados coletados mostraram pequena variação negativa no deslocamento de Hα em oito resíduos da ordem de 1,5% em média, quando comparados com os deslocamentos observados em condição ácida. O resíduo Gln-7 apresentou a maior variação negativa do deslocamento sendo 2,52% em relação à condição anterior. Somente o resíduo Ser1 apresentou variação positiva na ordem de 0,5%. Essas variações eram esperadas, visto que modificações de pH incrementam em torno de 0,3 ppm para núcleos Hα e cerca de 1,0 ppm para núcleos HN. Os dados de deslocamento químico para a condição de pH fisiológico são mostrados na Tabela 14.

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Tabela 14. Deslocamento químico observado para os resíduos de aminoácidos da cadeia principal do peptídeo Cn-AMP1, 1 Mm, pH fisiológico em tampão PBS e 25ºC com micelas de SDS-d25,100 Mm. Resíduo Ser-1 Val-2 Ala-3 Gly-4 Arg-5 Ala-6 Gln-7 Gly-8 Met-9 HN Hα Hβ 3,80 2,19 1,43 1,93 1,47 2,06 1,98 Outros 1,06(γCH3), 1,00(γCH3) 1,75(βH1), 3,23(δCH2), 7,20(εNH) 2,24(βH1), 2,44(γH) 2,12(βH1), 2,56(γH) Padrão de deslocamento AMX A3B3MX A3X AX A2(T2)MPX A3X AM(PT)X AX AM(PT)X

8,00 4,31 8,35 3,99 8,27 4,23 8,13 3,96 7,99 4,27 8,19 4,32 8.01 4,36 8,21 4,00 7,82 4,31

O aumento do pH ocasiona a variação na carga de cada resíduo, ao se afastar do ponto isoelétrico, assim os resíduos se tornam mais negativos provocando a repulsão, com os domínios negativos da micela, levando a variação do deslocamento químico, e consequentemente a perda da estruturação (SERRANO, 1995). O índice de deslocamento químico CSI, na condição de pH fisiológico e mostrado graficamente na Figura 28.

Figura 28. Índice de deslocamento químico para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, pH fisiológico em tampão PBS e 25 ºC como micelas de SDS-d25, 100 mM.
50

O cálculo de CSI mostra uma aproximação dos deslocamentos químicos de cada resíduo com relação aos valores teóricos, caracterizado pela alta densidade de valores zeros após a codificação, dando indícios de que o peptídeo tende a uma estrutura randômica, conforme protocolo anteriormente citado. As variações observadas no cálculo de CSI, podem se relacionar com uma possível competição pela interação com a micela, devido a complexação dos grupos fosfatos do tampão PBS com a Arg-5, protonada em pH 7,0. Essas variações podem ser visualizadas graficamente pela comparação das quatro condições experimentais, mostradas na Figura 29.

Figura 29. Comparação do índice de deslocamento químico (CSI) para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM, a 25ºC, A) sem micelas de SDS-d25 e pH 3,97; B) sem micelas de SDS-d25 e pH fisiológico; C) com micelas de SDS-d25 (100 mM) e pH 3,97 e D) com micelas de SDS-d25 (100 mM) e pH fisiológico em tampão PBS.

51

4.2.

Análise do NOESY 2D

4.2.1. Peptídeo Cn-AMP1 sem micelas de SDS-d25

O experimento de NOESY realizado sem a adição de SDS-d25 apresentou poucos sinais e de baixa intensidade, dificultando a análise das interações e a visualização dos sistemas de spins, fornecendo pouca informação sobre a estrutura tridimensional do peptídeo. A ausência de sinais de nOe interesiduais dá indícios de que o peptídeo se encontra em uma conformação randômica, não apresentando estrutura helicoidal, como previsto pelo cálculo de CSI para essa condição. A alta troca conformacional em torno dos resíduos Gly-4 e Gly-8, ocasionada pela pouca restrição estérica, leva a baixa intensidade dor sinais referentes a esses resíduos. Esse fato pode ser comprovado na Figura 30, onde é apresentado o mapa de correlação de NOESY.

Figura 30. Expansão da região de HN-Hα do mapa de contorno NOESY do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM sem micelas de SDS-d25, pH 3,97 e 25ºC.

52

4.2.2. Peptídeo Cn-AMP1 sem micelas de SDS-d25 em tampão PBS e pH fisiológico

O experimento de NOESY realizado sem a adição de SDS-d25 em pH fisiológico também apresentou poucos sinais e de baixa intensidade, dificultando a análise das interações e a visualização dos sistemas de spins, fornecendo pouca informação sobre a estrutura tridimensional do peptídeo. A ausência de sinais de nOe interesiduais dá indícios de que o peptídeo se encontra em uma conformação randômica, como previsto pelo cálculo de CSI. Esse fato pode ser comprovado pela pouca quantidade de correlações interesiduais no mapa de correlação NOESY mostrado na Figura 31.

Figura 31. Expansão da região de HN-Hα do mapa de contorno NOESY do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM sem micelas de SDS-d25, em tampão PBS, pH fisiológico e 25ºC.

4.2.3. Peptídeo Cn-AMP1 com micelas de SDS-d25 O experimento de NOESY apresentou sinais bem resolvidos e de boa intensidade, o que permitiu analisar núcleos acoplados dipolarmente. Esse tipo de
53

interação aparece quando os núcleos se encontram a uma distancia máxima de 5 Å, dessa forma é possível obter informações detalhadas a cerca da conformação tridimensional do peptídeo. As interações do tipo H, i, i+2, i+3 e i, i+4 e H, i+3, são interações características, quando o peptídeo se encontra estruturado de forma helicoidal. Tal tipo de estrutura facilita a interação do peptídeo com a membrana celular. Há que se destacar que estes tipos de interação são observados somente em conformação helicoidal da cadeia peptídica. Os tipos de interações destacados são apresentados no esquema da Figura 32.

Figura 32. Interações interesiduais observadas no experimento de NOESY devido ao acoplamento dipolar em uma cadeia polipeptídica, na conformação helicoidal.

A estrutura tridimensional do peptídeo Cn-AMP1 foi determinada após análise conjunta e simultânea dos mapas de contorno de NOESY e TOCSY, onde os sinais de nOe foram devidamente identificados e atribuídos no mapa de NOESY utilizando o método de atribuição sequencial (WÜTHRICH, 1986). Na metodologia mencionada os sinais de nOe correlacionam com os sinais observados no TOCSY, de modo que o Hα do resíduo i interage com o HN do resíduo posterior (i, i+1) e assim por diante. Conforme demonstrado na Figura 33.
54

Figura 33. Expansão da região de interação HN – H do mapa de contorno NOESY, mostrando o sinal de nOe que relaciona HN do resíduo Ala-3, com Hα da Val-2, do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC.

O mapa de contorno de NOESY apresentou sinais de boa intensidade de resolução. A análise dos sinais da região de interação HN – H do mapa de NOESY mostra as correlações entre o Hα do resíduo anterior com o HN do próximo resíduo vizinho na sequência peptídica ou estrutura primária. Essa constatação permitiu identificar interações interesíduais de curta (2,8 Å) e média (3,4 Å e 5,0 Å) distância dos resíduos da cadeia peptídica. Com a atribuição dos sinais do NOESY, pode-se então construir o mapa de conectividade Hα - HN para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM em SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, representado nas Figura 34. Os sinais destacados se referem a interações do tipo i, i+2, i+3 e i, i+4, sugerindo a conformação em hélice do peptídeo. A presença de correlações do tipo HN - Hα e HN - Hβ, (i+3 e i+4) da Ser-1, indicam a uma estruturação em alfa hélice nessa porção
55

do peptídeo, outro fator importante desses sinais de nOe é que eles tendem a conferir um sentido para a estrutura helicoidal.

Figura 34. Expansão da região de interação Hα - HN do mapa de NOESY, destacando o mapa de conectividade do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, destacadas as interações i, i+2, i+3 e i, i+4, características de estrutura em conformação helicoidal.

A ordem de conectividade dos resíduos do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM em SDS-d25, 100 mM é confirmada ao analisar a região de interação interesidual de H N HN (i, i+1), essa região é denominada de impressão digital, e as interações presentes encontram representadas na Figura 35.

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Figura 35. Expansão da região de HN-HN do mapa de NOESY, identificando a conexão entre os resíduos do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC.

4.2.4. Peptídeo Cn-AMP1 com micelas de SDS-d25 em tampão PBS e pH fisiológico

O mapa de correlação de NOESY para o peptídeo em tampão PBS e pH 7,0 apresentou poucos sinais e de baixa intensidade. Tal fato sugere uma dependência da estrutura tridimensional com o pH do meio em que o peptídeo se encontra, já que, alterações do pH implicam em redução da intensidade dos sinais, além de alteração dos deslocamentos químicos (SERRANO, 1995). Outro fator determinante para essa condição é a ausência de sinais interesiduais, sugerindo uma estruturação randômica como pode ser comprovado pela comparação dos mapas de correlação mostrados na Figura 36.

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Figura 36. Expansão da região de HN-Hα, onde são comparados os mapas de TOCSY e NOESY destacando a diferença no número de sinais na região em estudo do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, tampão PBS, pH fisiológico e 25 ºC.

4.3.

Atribuição sequencial da cadeia peptídica

Os dados de volume dos sinais do mapa de contorno NOESY do peptídeo em pH 3,97 e 25ºC foram convertidos em distância através do programa NMRPipe, sendo obtidas 118 restrições de distâncias (Tabela 11, Anexo 1C), com uma média de 13,1 restrições por resíduo, sendo 43 intraresiduais, 33 de curta distância e 42 interesiduais de média distância. As interações foram classificadas em curta e média distância com valores médios de 2,8 Å, 3,4 Å e 5,0 Å, definidas como curtas (2,8 Å) e médias distâncias (3,4 Å e 5,0 Å) (HYBERTS, 1992). As restrições de distâncias, inter e intraresiduais foram relacionadas e distribuídas, conforme o diagrama de nOe da Figura 37.

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Figura 37. Diagrama de conectividade de nOe, onde as linhas finas, médias e largas indicam as interações fracas, medias e fortes de curta distância, para o peptídeo CnAPM1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, o retângulo indica a região entre os resíduos onde a sobreposição das interações i, i+3 e i, i+4, características de estruturação em hélice.

O diagrama de conectividade de nOe mostra uma maior concentração de restrições de média distância do tipo dαN(i, i+3), num total de quatro, entre os resíduos Ser-1/Gly-4; Val-2/Arg-5; Ala-3/Ala-6 e também Arg-5/Gly-8. A presença dessas interações sugere a presença de um segmento estruturado em conformação helicoidal entre esses resíduos. As duas restrições do tipo dαN(i, i+4) observadas entre os resíduos Ser-1/Arg-5 e Arg-5/Met-9 indicam um bom ordenamento estrutural do peptídeo. O fato de não se detectar o sinal H N do resíduo Ser-1 sugere, certa dinâmica dessa porção do peptídeo, devido à labilidade dos hidrogênios amídicos, trocando rapidamente com o solvente. No entanto a presença de restrições do tipo Hα – HN do tipo i+1 e i+3 indicam estruturação em hélice do peptídeo também na porção N-terminal.

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A Figura 38 mostra a distribuição das principais interações interesiduais responsável pela estruturação do peptídeo por resíduo.

Figura 38. Principais interações interesiduais por resíduo, classificadas quando ao tipo, para o peptídeo Cn-APM1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC.

4.4.

Cálculo e análise das estruturas

A representação do peptídeo Cn-AMP1 é concebida por 200 estruturas geradas e tomadas as 20 conformações de menor energia global, obtendo-se assim uma família de conformações do peptídeo. Essas estruturas foram geradas desconsiderando os efeitos de interação de hidrogênio, visando não forçar as mesmas e foram visualizadas através do programa PyMOL (DELANO, 2002). Os dados estatísticos das estruturas encontram-se relacionados na Tabela 15.

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Tabela 15. Dados estatísticos das 20 estruturas de menor energia do peptídeo CnAMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. Cn-AMP1 Total de restrições de distância Intraresiduais |i – j| = 0 Curta distância Média distância (2 ≤ |i – j| ≤ 5) Média de restrições por resíduo RMSD (Å) todos os átomos RMSD (Å) hélice-α Energia (kcal/mol) Diagrama de Ramachandran Resíduos nas regiões favorecidas Resíduos nas regiões permitidas 95,1% 4,9% 118 43 33 42 13,1 0,43±0,16 0,25±0,19 10,9

Os valores de desvio médio quadrático (Root of Mean Square Deviations - RMSD),
calculados dentro do programa PyMOL, são

indicativos de boa flexibilidade

conformacional da estrutura, os valores são obtidos pela sobreposição das 19 estruturas de menor energia, comparadas com uma gerada randomicamente. Esses valores traduzem o desvio dos átomos do conjunto de estruturas de menor energia, em relação aos átomos da estrutura gerada de referência (randômica), indicando assim a flexibilidade das mesmas. Os valores de RMSD considerados ideais para proteínas se localizam no intervalo 1< RMSD >0,5, podendo variar para peptídeos. O valor apresentado para o peptídeo em estudo, apesar de estar abaixo do ideal 0,43±0,16, é representativo, já que, a variação se encontra dentro do erro previsto, além do fato de que o RMSD tende a oscilar com as dimensões da molécula, sendo que moléculas maiores implicam em maiores valores de RMSD. Nesse contexto, como o peptídeo em estudo conta com apenas nove resíduos na sua cadeia, justifica-se um menor valor para esse parâmetro (MAIOROV, 1994). A qualidade das estruturas é avaliada através da análise do diagrama de Ramachandran, inserido como parte integrante do programa PROCHECK-NMR (LASKOWSKI, 1996; LOVELL, 2002). O diagrama em questão é gerado considerando a variação dos
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ângulos de torção ϕ e ψ, e assim definindo quatro regiões designadas mais favorecida (A), permitida (B), menos permitida (C) e proibida (D). O diagrama de Ramachandran pode ser observado na Figura 39.

Figura 39. Diagrama de Ramachandran para as 20 estruturas de menor energia do peptídeo Cn-AMP1; 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, destacando as regiões: A) favorecida; B) permitida; C) generosamente permitida; D) proibida, em destaque a distribuição dos resíduos de Gly.

O peptídeo apresenta boa distribuição no diagrama de Ramachandran, com 95,1% dos resíduos se localizando em região favorável a alfa hélices, e que não apresentam impedimento de natureza estérica (em azul escuro) e 7,9% na região generosamente permitida (em laranja), de menor estabilidade energética, porém a flexibilidade dos ângulos de torção permite que sejam acessadas. Somente a Glicina que confere grande flexibilidade à estrutura devido ao pouquíssimo impedimento de
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natureza estérica, ocasionado pela ausência de cadeia lateral, está localizada nessa região, favorável a esse resíduo. Dessa forma o diagrama de Ramachandran para o peptídeo Cn-AMP1, indica uma boa qualidade das estruturas obtidas. A Figura 40 representa a sobreposição das 20 estruturas de menor energia do peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM pH 3,97 e 25 ºC.

Figura 40. Representação da sobreposição das 20 estruturas de menor energia do peptídeo Cn-AMP1, em diferentes perspectivas, obtidas pelo método de recozimento simulado, para uma solução de peptídeo, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC. Onde pode ser observada: A) a formação helicoidal entre os resíduos Ser-1 e Ala-6 e B) a distribuição dos resíduos hidrofóbicos (vermelho) na estrutura.

A estrutura tridimensional do peptídeo Cn-AMP1, Figura 40, apresenta estruturação helicoidal entre os resíduos Ser-1 até Ala-6, representando um conteúdo helicoidal de 66,7%. No entanto, devido à dinâmica conformacional, o resíduo de Ser-1, não forma uma hélice efetiva, apesar de apresentar interações i, i+3 e i, i+4 que acenam para a sua formação, como pode ser observado pela tendência de estruturação na Figura 40. A molécula não apresenta estruturação em hélice na porção C-terminal, entre os resíduos Gln-7 e Met-9. A mobilidade conferida
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pela presença da Gly-8, associada à proximidade de dois resíduos hidrofílicos, Gln-7 e Gly-8, sugere serem as causas prováveis para a conformação randômica nessa porção da molécula. Os cálculos de anfipaticidade indicaram uma taxa hidrofóbica de 25,0%, dada pelo momento hidrofóbico relativo, conforme pode ser observado na Figura 41, onde é representada a projeção de Edmunson.

Figura 41. Representação da projeção de Edmunson para o peptídeo Cn-AMP1, 1 mM com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25 ºC, onde a intensidade dos vetores indica o índice de hidrofobicidade de cada resíduo.

O conhecimento do momento hidrofóbico do peptídeo é importante, visto que, define o perfil anfipático do peptídeo, importante para a interação com a superfície celular. A conformação anfipática do peptídeo Cn-AMP1, foi avaliada realizando experimento de troca de D2O, onde são adquiridos mapas de correlação TOCSY 2D, a fim de avaliar a cinética de troca dos hidrogênios alfa de cada resíduo por deutério. Para o experimento foi preparada uma solução contendo 550 μL de 60% D2O e 40% H2O, em pH 3,97 do peptídeo. Foram coletados 12 mapas de correlação de TOCSY 2D, nas condições experimentais apresentadas inicialmente, porém com TD F1 de 1k e F2 de 128, visando o aumento da intensidade dos sinais, via aumento do o número de scans, num total de 24, demandando 1:01h por experimento. Observou64

se, já no primeiro experimento o aparecimento dos sinais em δ 3,97 ppm; δ 4,14 ppm e δ 3,81 ppm atribuídos à Val-2; Ala-3 e Gly-4, respectivamente, após 1:01h. Após 7:07h de experimento, observaram-se os sinais em δ 3,86 ppm; δ 3,80 ppm e δ 4,24 ppm e δ 4,31 ppm atribuídos à Gly-8; Gly-4; Gln-7 e Met-9, respectivamente. Ao final de 12:12h de experimento foram observados sinais de baixa intensidade na região de impressão digital, em δ 3,89 ppm; δ 4,25 ppm e δ 4,31 ppm, os quais foram atribuídos ao Hα dos resíduos de Gly-4; Arg-5 e Met-9, respectivamente. Como pode ser observado na Figura 42A; 42B; 42C e 42D.

Figura 42. Representação da região de impressão digital do mapa de correlação TOCSY 2D do peptídeo Cn-AMP1, 1mM, com micelas de SDS-d25, 100 mM, pH 3,97 e 25ºC. A) TOCSY original 90% H2O e 10% D2O; B) TOCSY troca H/D, 40% H2O e 60% D2O após 1h e 01 min; C) TOCSY troca H/D, 40% H2O e 60% D2O após 7h e 07 min; D) TOCSY troca H/D, 40% H2O e 60% D2O após 12h e 12 min.

O experimento de troca H/D mostrou que a grande maioria dos sinais de H α da região de interação HN - Hα, responsáveis pela interação do peptídeo com a membrana celular desapareceu, permanecendo somente aqueles atribuídos a Gly-4, Arg-5 e Met-9, sugerindo uma menor acessibilidade do solvente a estes resíduos,
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devido à interação com a micela. No caso do resíduo de Met-9, que não se localiza em região de hélice, a menor susceptibilidade a troca sugere que tal resíduo deve se encontrar imerso na micela, elevando o tempo para essa troca. Os resultados do experimento de troca H/D juntamente com a presença do resíduo carregado positivamente (Arg-5) nessa região, aliado a hidrofobicidade e anfipaticidade do peptídeo, indicam ser essa a face de possível interação com a membrana celular. Outro fator importante a se considerar é que em pH ácido (3,97), os resíduos de aminoácidos se encontram abaixo do seu ponto isoelétrico (pI). O ponto isoelétrico pode ser determinado por titulação com acido acético e calculado pela media dos valores de pKa de cada aminoácido (LEHNINGER, 1982). Dessa forma, em pH ácido os resíduos se tornam mais positivo, o que favorece a interação com os domínios negativos da superfície celular. No entanto em pH fisiológico os resíduos se encontram acima do ponto isoelétrico e resíduos como a glicina e alanina (pI = 5,97), tendem a se tornarem mais negativos frente ao meio, aumentando a repulsão entre as cadeias laterais e com os domínios negativos dos grupos fosfatos presentes membrana. Dessa forma a interação com a superfície da membrana é reduzida. Assim o peptídeo assume uma conformação randômica nessa condição. A Figura 43 mostra a possível região de interação do peptídeo com a membrana.

Figura 43. Representação da estrutura de menor energia global do peptídeo CnAMP1, 1 mM, pH 3,97 com micelas de SDS-d25, 100 mM e 25ºC. A cor azul mostra a região de possível interação com a membrana celular.

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5. Conclusões As análises realizadas por meio da técnica de RMN mostraram que o peptídeo Cn-AMP1 se estrutura em hélice na região compreendida entre os resíduos Ser-1 e Ala-6, correspondendo a um conteúdo helicoidal de 66,7%, indicando estruturação randômica na ausência de micelas. Na condição de pH fisiológico foi observado um comportamento semelhante, onde o peptídeo apresenta uma conformação randômica, indicando uma relação do pH com a estruturação do peptídeo. A causa provável para a estruturação randômica do Cn-AMP1 em pH fisiológico está na redução da interação com a membrana, devido ao

comportamento dos resíduos Gly-4; Gly-8; Ala-3 e Ala-6, que ultrapassam o ponto isoelétrico nessa condição. Ao ultrapassarem o pI esses resíduos tendem a se tornar mais negativos, o que induz a repulsão entre as cadeias laterais e com os domínios fosfolipídios da membrana, ou ainda, a possível complexação com o tampão PBS estabelecendo assim, uma competição pela interação com a membrana. Outros fatores como a mobilidade conformacional devido à presença dos resíduos de Gli-4 e Gly-8, que não apresentam cadeia lateral carbônica. Dessa forma, os resíduos citados possuem reduzido impedimento estérico conferindo alta flexibilidade à cadeia peptídica. A mobilidade da cadeia peptídica pode provocar alterações no deslocamento químico dos núcleos, além da baixa intensidade e até falta de sinais de correlação interesidual (nOe), no experimento de NOESY. Esses fatores corroboram as observações destacadas. Os experimentos de troca de deutério mostraram que os resíduos Gly-4; Arg5 e Met-9 se encontram menos acessíveis ao solvente, dado o maior tempo de troca H/D observado, indicando a sua menor mobilidade, sugerindo ser a face que contém os resíduos Gly-4 e Arg-5, aquela de provável interação com a superfície da micela, demostrando o caráter anfipático do peptídeo. Esse fato confirma a importância da carga líquida positiva do resíduo Arg-5 para a interação entre o peptídeo e a membrana. A menor susceptibilidade do resíduo Met-9 se deve provavelmente por estar inserida na micela ficando pouco acessível ao solvente. A espectroscopia de RMN de 1H no estado líquido através de experimentos bidimensionais demonstra grande praticidade no estudo da estrutura tridimensional de biomoléculas, como o Cn-AMP1, um peptídeo de pequena dimensão, que é o primeiro constituinte de uma classe de defesa, com caráter promíscuo sem interação
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de dissulfeto, isolado de plantas. Dessa forma, os experimentos de RMN na fase líquida, resguardam a condição natural em que essas moléculas são encontradas, promovendo a mínima manipulação da amostra, além de apresentar boa sensibilidade, dada quantidade reduzida de amostra utilizada nos experimentos, em torno de 0,47 mg.

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75

Anexo IA

Tabela 1. Propriedade da cadeira lateral dos 20 aminoácidos essenciais. Estrutura geral dos aminoácidos Aminoácido (nome, símbolo) Glicina (Gly, G) Cadeia lateral (R) Propriedade da cadeia lateral
A glicina oferece o mínimo de impedimento estérico à rotação e a grupos adjacentes, funcionando somente como um elo da cadeia peptídica.

-H

Alanina (Ala, A)

Valina (Val, V)
OOC C H 3N H R

Leucina (Leu, L)

Aminoácidos com grupos alquil na cadeia lateral apresentam grupos volumosos e de formas distintas, participam de interações hidrofóbicas no interior de proteínas e na formação de centros de ligação específicos.

Isoleucina (Ile, I)

Prolina (Pro, P)

A prolina é um iminoácido. Apresenta grupo amino secundário de conformação relativamente rígida. A presença da prolina influencia fortemente na estrutura da proteína ou peptídeo.

Fenilalanina (Phe, F)

Aminoácidos aromáticos (segue)

Anexo IA Tabela 1. Continuação.

Tirosina (Tyr, Y)
Tirosina, Fenilalanina e Triptofano podem formar ligações hidrofóbicas e podem ser eficazes na ligação com outras moléculas planas.

Triptofano (Trp, W)

OOC C H 3N H R

Serina (Ser, S)

Treonina (Thr, T)

O grupo OH é fracamente ácido e pode formar ésteres com ácido fosfórico ou ácidos orgânicos. É ainda um sitio de ligação de anéis de açúcar em glicoproteínas e a hidroxila da serina se encontra em centros ativos de algumas enzimas

Ácido Aspártico (Asp, D)
Aminoácidos ácidos. Os grupos carboxílicos das cadeias laterais destes aminoácidos se dissociam em pH neutro e fornecem ânions às superfícies de proteínas.

Ácido Glutâmico (Glu, E)

Asparagina (Asn, N)

Aminoácidos amídicos. O grupo amida não é ácido, porem é polarizado na ligação de hidrogênio. (segue).

Anexo IA Tabela 1. Continuação.
Não sendo certa posição do ácido aspártico em designa-se ou uma por

Glutamina (Gln, Q)

asparagina proteína,

Asx ou B. Em caso de ácido glutâmico ou glutamina, dizse Glx ou Z.

Cisteína (Cys, C)

Aminoácidos contem enxofre.

que

Os dois grupos SH da cisteina unidos podem por ser

oxidação ponte de

Metionina (Met, M)

formando dissulfeto.

Os

grupos

imidazol

da

OOC C H 3N H R

cadeia lateral da histidina

Histidina (His, H)

fazem

parte

dos

sítios

ativos de enzimas, assim como outros grupos básicos que também podem se ligar a íons metálicos. A lisina apresenta uma

cadeia lateral flexível com

Lisina (Lys, K)

um

grupo

amino reativo, elevado

potencialmente tendo um pKa

possibilita a cadeia lateral seja protonada. O grupo guanidina possui pKa elevado e é protonoado

Arginina (Arg, R)

na maioria dos casos. Ele é estabilizado por

ressonância, são centros de ligação do fosfato ou grupos carboxilato por pares de ligação de hidrogênio.

Anexo IB

Tabela 4. Padrões de deslocamento químico dos 20 resíduos de aminoácidos, adaptado de (CHARY e GOVIL, 2008, WÜTHRICH, 1986). Sistema de spin TOCSY Resíduos Características

O sistema AX apresenta um pico cruzado, devido do acoplamento do tipo geminal (J≈ 16 Hz). Gly

O sistema A3X tem um grupo metila acoplado ao Ha, gerando um pico cruz forte e de alto desvio químico entre os spins da Ala rede. O sistema AMX se caracteriza pela por três prótons não trocáveis 1Ha e 2Hb, onde em geral é observado somente um, dada a Asn; Asp; Cys; Ser. diferença de intensidade entre eles. Porém o acoplamento geminal entre os prótons Hb gera alta intensidade dos sinais. Esses sistemas além de um Ha e dois Hb, que formam sistema AMX, eles possuem prótons aromáticos, que nao acoplam escalarmente com ao sistema de spins. Os His picos cruzados aparecem na mesma região dos resíduos de Asp, Asn e Cys. Uma vez

Anexo IB que não há acoplamento observáveis entre Hb e prótons nos anéis aromáticos,

correlacionados nos mapas de correlação não podem ser utilizados para diferenciáTyr los. No entanto, devido à proximidade espacial de Ha e Hb para com os protões do anel, estes sistemas podem ser Essa

identificados

usando

NOESY.

estratégia pode ser usada para distinguir Ha, Hb e os prótons do anel de His, embora as distâncias entre Ha, Hb e o anel nesse sistema são maiores. Esses sistemas além de um Ha e dois Hb, que formam sistema AMX, eles possuem prótons aromáticos, que nao acoplam escalarmente com ao sistema de spins. Os Phe picos cruzados aparecem na mesma região dos resíduos de Asp, Asn e Cys. Uma vez que não há acoplamento observáveis entre Hb e prótons nos anéis aromáticos,

correlacionados nos mapas de correlação não podem ser utilizados para diferenciáTrp los. No entanto, devido à proximidade espacial de Ha e Hb para com os protões do anel, estes sistemas podem ser Essa

identificados

usando

NOESY.

estratégia pode ser usada para distinguir Ha, Hb e os prótons do anel de His, embora as distâncias entre Ha, Hb e o anel nesse sistema são maiores.

Anexo IB

Nesse sistema ocorre inversão entre os Gln; Glu; Met. deslocamentos químicos de Hb e Hg, onde os sinais de Hb apresentam menor

deslocamento químico que Hg.

Nesse sistema o próton Hg nos mapas de correlação, caso ocorra interação de

hidrogênio, podendo os deslocamentos de Hb ser maiores que os de Ha. É observado Thr ainda correlações entre Ha-gCH3 e HbgCH3, com sinais que se assemelham à correlação Ha-bCH3 da alanina, porém de menor intensidade.

O sistema A3B3MX é caracterizado por uma Val correlação Ha-Hb e duas correlações HbHg.

O sistema A3B3MPTX, apresenta dois prótons Hb e Hg, localizados em uma região densa do mapa de correlação, sendo mais interessante

Leu

utilizar na atribuição da rede o TOCSY 2D, para atribuir os picos Ha, Hg, Hd1 e Hd2.

Anexo IB

Nesse sistema ocorre forte correlação entre Ha-gCH3 e média entre Ha-dCH3, ambas observadas no TOCSY e ainda interações Ile de media intensidade entre HN-gCH3 e HNdCH3. O sistema A2(T2)MPX, apresenta forte correlação entre gCH2-dCH2, tanto no TOCSY quanto no COSY, com os picos HN-dCH2, Arg; Pro sinais de muito fracos ou ausentes,

raramente aparece o pico HN-eNH. Os acoplamento com eNH

geralmente se alargam ou desaparecem, tornando o sistema semelhante a Lisina. O sistema A2(F2T2)MPX, apresenta forte correlação entre gCH2-dCH2, tanto no TOCSY quanto no COSY, com os picos HN-dCH2, Lys sinais de muito fracos ou ausentes,

raramente aparece o pico HN-eNH. Os acoplamento com eNH

geralmente se alargam ou desaparecem, tornando o sistema semelhante a Arginina.

Anexo IC

Tabela 11. Restrições do peptídeo Cn-AMP1 em micelas de SDS-d25, pH 3,97 e 25ºC. assign (resid 1 and name HT#) (resid 1 and name HA) 5.00 3.20 0.5! assign (resid 1 and name HB#) (resid 3 and name HB#) 5.00 3.20 0.5! assign (resid 1 and name HB#) (resid 1 and name HG) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 1 and name HB#) (resid 2 and name HB) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 2 and name HN) (resid 2 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 2 and name HN) (resid 2 and name HB) 2.80 1.00 0.5 ! noesy.7 noesy.75 noesy.81 noesy.121 noesy.0 noesy.8

assign (resid 2 and name HN) (resid 2 and name HG##) 3.40 1.60 0.5 ! noesy.29 assign (resid 2 and name HN) (resid 1 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 2 and name HN) (resid 1 and name HB#) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 2 and name HN) (resid 1 and name HG) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 2 and name HA) (resid 2 and name HG##) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 2 and name HA) (resid 2 and name HB) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 2 and name HB) (resid 1 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 2 and name HB) (resid 2 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 2 and name HG##) (resid 2 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 2 and name HA) (resid 5 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 2 and name HB) (resid 2 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 2 and name HB) (resid 3 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! noesy.32 noesy.33 noesy.35 noesy.77 noesy.80 noesy.97 noesy.98 noesy.109 noesy.129 noesy.138 noesy.139

assign (resid 2 and name HG##) (resid 2 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! noesy.156 assign (resid 2 and name HG##) (resid 3 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.158 assign (resid 2 and name HG##) (resid 4 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.160 assign (resid 2 and name HA) (resid 2 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 2 and name HN) (resid 3 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 3 and name HA) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 3 and name HB#) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 1 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 1 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 2 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 2 and name HB) 3.40 1.60 0.5 ! noesy.163 noesy.168 noesy.1 noesy.10 noesy.38 noesy.39 noesy.41 noesy.42

assign (resid 3 and name HN) (resid 2 and name HG##) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.43 assign (resid 3 and name HB#) (resid 1 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 3 and name HB#) (resid 3 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! noesy.107 noesy.151

Anexo IC assign (resid 3 and name HB#) (resid 5 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 3 and name HA) (resid 3 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 2 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 4 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 3 and name HN) (resid 1 and name HG) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 4 and name HA#) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 3 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 1 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 2 and name HB) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 6 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.155 noesy.164 noesy.170 noesy.171 noesy.189 noesy.4 noesy.45 noesy.56 noesy.57 noesy.60

assign (resid 4 and name HN) (resid 2 and name HG##) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.61 assign (resid 4 and name HN) (resid 5 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 3 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 1 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 1 and name HG) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 4 and name HN) (resid 2 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 5 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 5 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 5 and name HG#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HE) (resid 5 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HE) (resid 5 and name HG#) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 5 and name HE) (resid 5 and name HB#) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 2 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 6 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 3 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HG#) (resid 5 and name HB#) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 5 and name HB#) (resid 8 and name HA#) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.174 noesy.175 noesy.190 noesy.195 noesy.196 noesy.5 noesy.13 noesy.14 noesy.21 noesy.22 noesy.23 noesy.62 noesy.68 noesy.69 noesy.83 noesy.100

assign (resid 5 and name HB#) (resid 5 and name HG#) 2.80 1.00 0.5 ! noesy.101 assign (resid 5 and name HG#) (resid 8 and name HA#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HG#) (resid 5 and name HE) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 5 and name HB#) (resid 5 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HB#) (resid 8 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HB#) (resid 5 and name HE) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 4 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! noesy.119 noesy.137 noesy.149 noesy.150 noesy.162 noesy.180

Anexo IC assign (resid 5 and name HN) (resid 3 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 1 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 5 and name HN) (resid 4 and name HA#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HN) (resid 6 and name HA) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 6 and name HN) (resid 2 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HN) (resid 5 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HA) (resid 7 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HB#) (resid 8 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HB#) (resid 4 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HB#) (resid 5 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HN) (resid 3 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HN) (resid 3 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HN) (resid 4 and name HA#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 6 and name HN) (resid 5 and name HA) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 6 and name HN) (resid 5 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 7 and name HN) (resid 7 and name HA) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 7 and name HN) (resid 7 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 7 and name HG#) (resid 7 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 7 and name HA) (resid 7 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 7 and name HA) (resid 7 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 7 and name HN) (resid 6 and name HN) 3.40 1.60 0.5 ! assign (resid 7 and name HN) (resid 9 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 7 and name HN) (resid 6 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 7 and name HN) (resid 5 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 8 and name HN) (resid 8 and name HA#) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 8 and name HN) (resid 6 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 8 and name HN) (resid 7 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 8 and name HN) (resid 7 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 8 and name HN) (resid 5 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 8 and name HA#) (resid 9 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 8 and name HA#) (resid 8 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 8 and name HN) (resid 7 and name HN) 2.80 1.00 0.5 ! assign (resid 8 and name HN) (resid 9 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 8 and name HN) (resid 5 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.197 noesy.198 noesy.202 noesy.2 noesy.47 noesy.51 noesy.124 noesy.152 noesy.153 noesy.154 noesy.176 noesy.191 noesy.208 noesy.213 noesy.214 noesy.6 noesy.17 noesy.89 noesy.122 noesy.125 noesy.181 noesy.187 noesy.203 noesy.209 noesy.3 noesy.11 noesy.46 noesy.49 noesy.52 noesy.126 noesy.133 noesy.172 noesy.173 noesy.200

Anexo IC assign (resid 8 and name HN) (resid 6 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 9 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 9 and name HG#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 9 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 7 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 8 and name HA#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 5 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.205 noesy.25 noesy.18 noesy.19 noesy.20 noesy.66 noesy.70

assign (resid 9 and name HG#) (resid 9 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.86 assign (resid 9 and name HG#) (resid 7 and name HB#) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HB#) (resid 7 and name HG#) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.88 noesy.102

assign (resid 9 and name HB#) (resid 9 and name HG#) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.113 assign (resid 9 and name HG#) (resid 9 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HB#) (resid 9 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 8 and name HN) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 7 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! assign (resid 9 and name HN) (resid 5 and name HA) 5.00 3.20 0.5 ! noesy.142 noesy.145 noesy.179 noesy.194 noesy.206