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Tipo do documento: Artigo publicado em periódico científico
Título: Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico da pancitopenia tropical canina por PCR
Título(s) alternativo(s): Assessment of primers and protocol for the diagnosis of the tropical canine pancytopeniaby PCR
Autor: Alves, Luciano Marra
Linhares, Guido F. C.
Chaves, Nilo Sérgio T.
Monteiro, Letícia C.
Linhares, Daniel C. L.
Resumo: Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de padronizar um protocolo para a reação em cadeia da polimerase (PCR) e selecionar oligonucleotídeos iniciadores para a detecção específica de Ehrlichia canis, em uma única etapa de reação. Inicialmente foram obtidas seqüências depositadas no Genbank, referentes ao gene que codifica o 16S rRNA das espécies E. canis (número de acesso = AF162860), E. ewingii (U96436), E. platys (AF1567844), E. chaffeensis, (U86665), E. phagocytophila genogrupo (U02521), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290), as quais foram submetidas ao alinhamento genético para a construção dos iniciadores. Do alinhamento foi selecionado, a partir de uma região semiconservada, um iniciador específico para E. canis, designado EBR1 (5’- cctctggctataggaaattg- 3’) e, de uma região conservada, um iniciador genérico EBR5 (5’-ggagtgcttaacgcgttag- 3’). Paralelamente foram obtidas amostras de sangue de dez cães que apresentavam infecção aguda por E. canis, confirmado pela presença de mórulas intracitoplasmáticas, características da riquétsia, em células mononucleares sangüíneas. O DNA genômico extraído dessas amostras foi utilizado para a avaliação da reação de PCR, empregando-se um protocolo adaptado de outros autores e o par de oligos EBR1/EBR5, selecionado neste trabalho. A reação de PCR apresentou resultados positivos para os 10 isolados de E. canis, amplificando o fragmento esperado de 765 pares de bases do gene 16S rRNA. Resultados negativos verificados nas reações de PCR para amostras de DNA genômico de Babesia canis, Hepatozoon canis, Haemobartonella sp.,Trypanosoma evansi e do hospedeiro (Canis familiaris) livre de infecção indicaram a segurança do método quanto à especificidade para a discriminação de E. canis.
Abstract: The study was conducted in an attempt to evaluate a protocol and to select primers for the specific diagnosis of Ehrlichia canis by a single-step PCR assay. Sequences of the 16S rRNA gene of the species E. canis (access number = AF162860), E. ewingii (U96436), E. platys (AF1567844), E. chaffeensis, (U86665), E. phagocytophila genogroup (U02521), E. bovis (AF294789) and E. risticii (M21290) were obtained from the Genbank database and then aligned for primer selection. From a semi-conserved region of the alignment it was selected the E. canis specific forward primer which was designated EBR1 (5’- ctctggctataggaaattg- 3’) and, from a conserved region, it was selected a reverse generic primer named EBR5 (5’-ggagtgcttaacgcgttag-3’). Blood samples were collected from ten dogs that were undergoing acute phase of E. canis infection, confirmed by the demonstration of the rickettsia characteristic intracitoplasmatic morulae within the agranulocitic blood cells. The genomic DNA was extracted from each of the blood samples in order to be used for the assessment of the PCR assay in order to evaluate the protocol and the primer pair (EBR1/EBR5) selected in this study. The PCR reaction was positive for all ten isolates of E. canis, yielding the expected fragments of 765 bp size of the 16 S rRNA gene. The lack of positive results with genomic DNA of Babesia canis, Hepatozoon canis, Haemobartonella sp., Trypanosoma evansi and of uninfected host (Canis familiaris) assured confidence on the specivicity of the method for E. canis discrimination.
Unidade acadêmica: Escola de Veterinária e Zootecnia - EVZ (RG)
Citação: ALVES, Luciano Marra; LINHARES, Guido; CHAVES, Nilo Sérgio; MONTEIRO, Letícia; LINHARES, Daniel. Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico da pancitopenia tropical canina por PCR. Ciência Animal Brasileira, Goiânia, v. 6, n.1, jan./mar. 2005. Disponível em: <http://www.revistas.ufg.br/index.php/vet/article/view/344/319>.
Tipo de acesso: Open Access
URI: http://repositorio.bc.ufg.br/handle/ri/150
Data de publicação: 2005
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