Desenvolvimento de plataforma multiparamétrica substitutiva ao uso de animais de laboratório para avaliação do potencial alergênico de misturas da “vida real”

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dc.contributor.advisor1Valadares, Marize Campos
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/6157755243167018eng
dc.contributor.referee1Valadares, Marize Campos
dc.contributor.referee2Cordeiro, Lorena Rigo Gaspar
dc.contributor.referee3Fonseca, Simone Gonçalves da
dc.contributor.referee4Souza, Pedro Paulo Chaves de
dc.contributor.referee5Cunha, Luiz Carlos da
dc.creatorMarcelino, Renato Ivan de Ávila
dc.creator.Latteshttp://lattes.cnpq.br/2534628830284658eng
dc.date.accessioned2019-02-26T11:41:36Z
dc.date.issued2018-12-07
dc.description.abstractAnimal experimentation has been a great ally of man in the progress of Sciences. However, the predictive capacity of in vivo models to identify toxic chemicals to humans has been widely debated. The advance of the 21st Century scientific knowledge has promoted the search for predictive models that consider the human physiology as well as the pathophysiology of the physically and chemically induced-adverse reactions. In this context, the present study focused on the evaluation of dermal toxicity of ingredients of hair dyes and agrochemicals and their finished products, referred to herein as "real-life" mixtures (the real condition of which the consumer is exposed to). An integrated strategy of in vitro tests was developed to evaluate the potential of these materials to induce allergic reactions when in contact with human skin. This strategy involved different human-relevant innovative techniques based on key-events of the adverse outcome pathway of skin sensitization (protein reactivity, activation of keratinocytes and/or dendritic cells). The first method implemented in house was the direct peptide reactivity assay (DPRA, OECD 442C/2015). The refinement process conducted was able to reduce the final reaction volume of the test, yielding in considerable reduction of cost and use of organic solvents. These modifications allowed the "minituarization of the technique", called micro-DPRA (mDPRA), which showed a similar performance to conventional DPRA in the identification of allergenic substances and finished products as surfactants and glyphosate-containing formulations. A second refinement led to the development of the photo-mDPRA, a technique capable of identifying contact photoallergens, which was not possible by the already validated phototoxicity technique (3T3 neutral red uptake phototoxicity test - OECD 432/2004). Similar to mDPRA, photo-mDPRA showed applicability to pure substances and mixtures based on glyphosate and surfactants. This work also established an in vitro multiparametric platform to evaluate the skin sensitization of cosmetic materials: cosmetic ingredients and hair dye products containing henna [Lawsonia inermis (Lythraceae)]. In addition to mDPRA and photo-mDPRA, seven different innovative methods were implemented. Four of them showed superior capacity to identify cosmetic ingredients with allergenic potential as compared to the traditional rodent models, which are: mDPRA, measurement of interleukin (IL)-18 in human HaCaT keratinocytes, U937 cell line activation test (U-SENSTM, OECD 442E/2018) and genomic allergen rapid detection (GARDTM skin). GARDTM skin had the highest predictive capacity in relation to human data (concordance = 100%), while mDPRA (concordance = 91.7%), measurement of IL-18 in HaCaT keratinocytes and U-SENSTM (both with concordance = 92.3%) showed similar predictions. Expanding the applicability of this strategy, it was used to evaluate ten natural henna-containing hair dye products sold in commercial establishments located in Goiânia, GO, Brazil. The first step was the label analysis followed by characterization and quantification of the potent contact allergen pphenylenediamine (PPD) and the henna biomarker lawsone using high performance liquid chromatography. In contrast to what was stated in the labels by the manufacturers, the chromatographic analyses showed that all products contained PPD, and one of them did not present detectable contents of lawsone. Therefore, revealing the adulteration and falsification of henna products. Furthermore, toxicological evaluation using the integrated in vitro testing approach established in this study showed that hennas generally triggered high peptide reactivity, increased IL-18 levels in HaCaT keratinocytes and CD86 expression in U937 cells in U-SENSTM assay, and induced changes in the 200 genes from the GARDTM skin predictive signature. Additionally, all hennas had the potential to trigger allergic contact dermatitis in humans. In parallel, hair dye ingredients, including PPD, promoted modulation of genes related to the oxidative stress response in human HaCaT keratinocytes, including nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2), heme oxygenase 1 (HO1), and Fos proto-oncogene (FOS). Therefore, the toxicological consequences and the associated risks of undeclared use of PPD in natural henna products are highlighted, which include sensitization of susceptible consumers and cases of allergic contact dermatitis in previously sensitized individuals. In addition, this study contributes to promotion of innovation and technological autonomy of Brazil within the area of Toxicology for the 21st Century through the establishment and development of an in vitro human-relevant approaches for skin sensitization assessment.eng
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dc.description.resumoA experimentação animal tem sido um grande aliado do homem no progresso da Ciência. Contudo, muito tem se discutido sobre a capacidade preditiva desses modelos in vivo em identificar substâncias químicas tóxicas para o ser humano. O avanço do conhecimento científico do Século XXI tem incentivado a busca de modelos preditivos que considerem a fisiologia do organismo humano, bem como a fisiopatologia das reações adversas física e quimicamente induzidas. Nesse contexto, o foco do presente estudo foi a avaliação de toxicidade dérmica de ingredientes de tinturas de cabelo e agrotóxicos e seus produtos acabados, denominados aqui de misturas da “vidareal” (a real condição que o consumidor está exposto). Uma estratégia integrada de testes in vitro foi desenvolvida para avaliar o potencial desses materiais em induzir reações alérgicas quando em contato com a pele humana. Essa estratégia envolveu diferentes técnicas inovadoras de relevância humana baseadas em eventos-chave da via do efeito adverso da sensibilização dérmica (reatividade com proteínas, ativação de queratinócitos e/ou células dendríticas). O primeiro método implementado “in house” foi o teste denominado direct peptide reactivity assay (DPRA, OECD 442C/2015). No processo de implementação, um refinamento voltado na redução do volume final de reação do ensaio foi realizado e, desta forma, o custo e o uso de solventes orgânicos foram reduzidos consideravelmente. Essas modificações permitiram a “miniaturização da técnica”, denominada micro-DPRA (mDPRA), a qual apresentou desempenho similar ao DPRA convencional na identificação de substâncias alergênicas e produtos acabados como formulações de agrotóxicos contendo glifosato e surfactantes. Além disso, foi estabelecido um segundo refinamento que originou o desenvolvimento de outra técnica, o photo-mDPRA, capaz de identificar fotoalérgenos de contato, o que não era possível pela técnica disponível de fototoxicidade já validada (3T3 neutral red uptake phototoxicity test – OECD 432/2004). Da mesma forma que o mDPRA, o photo-mDPRA também apresentou aplicabilidade para substâncias puras e misturas baseadas em glifosato e surfactantes. Outro ponto desse trabalho foi o estabelecimento de uma plataforma multiparamétrica in vitro para avaliação da sensibilização dérmica de materiais cosméticos: ingredientes cosméticos e produtos naturais de tintura capilar contendo henna [Lawsonia inermis (Lythraceae)]. Além do mDPRA e photo-mDPRA, foram implementados outros sete diferentes ensaios inovadores. Entre eles, quatro apresentaram superioridade frente aos tradicionais modelos em roedores na identificação de ingredientes cosméticos com potencial alergênico: mDPRA, quantificação de interleucina (IL)-18 em queratinócitos humanos HaCaT, U937 cell line activation test (U-SENSTM, OECD 442E/2018) e genomic allergen rapid detection (GARDTM skin). O GARDTM skin obteve a melhor capacidade preditiva em relação aos dados humanos (concordância = 100%), enquanto que mDPRA (concordância = 91,7%), quantificação de IL-18 em queratinócitos HaCaT e U-SENSTM (ambos com concordância = 92.3%) apresentaram predições similares. Expandindo a aplicabilidade dessa estratégia, ela foi utilizada para avaliar dez produtos naturais de tintura capilar contendo henna, vendidos em estabelecimentos comerciais localizados em Goiânia, GO, Brasil. Como primeiro passo, foram realizadas a análise de rótulo e a caracterização dessas misturas da “vida real” por cromatografia líquida de alta eficiência. Para isso, foram avaliadas quanto à presença do potente alérgeno de contato p-fenilenodiamina (p-phenylenediamine, PPD) e do biomarcador da henna, o lawsone. Contrastando com o que foi declarado nos rótulos pelos fabricantes, as análises cromatográficas evidenciaram que todos os produtos continham PPD e um deles não apresentou teores detectáveis de lawsone. Portanto, deparou-se com duas problemáticas: adulteração e falsificação de produtos henna. Além disso, a avaliação toxicológica utilizando a abordagem integrada de testes in vitro estabelecida nesse trabalho mostrou que, de forma geral, as hennas desencadearam alta reatividade peptídica, aumento dos níveis de IL-18 em queratinócitos HaCaT e de expressão de CD86 em células U937 no ensaio U-SENSTM, e induziram alterações nos 200 genes que compõem a assinatura preditiva do GARDTM skin. Desse modo, outra problemática foi encontrada nesses produtos testados: todas as hennas apresentaram potencial em promover dermatite de contato alérgica em humanos. Em paralelo, também foi verificado que os ingredientes de tintura capilar, incluindo o PPD, promoveram modulação de genes relacionados à resposta ao estresse oxidativo em queratinócitos humanos HaCaT, entre eles: nuclear factor erythroid 2- related factor 2 (NRF2), heme oxygenase 1 (HO1), e Fos proto-oncogene (FOS). Assim, ressaltam-se as conseqüências toxicológicas do uso não declarado de PPD em produtos naturais à base de henna, bem como os riscos associados, que podem envolver a sensibilização de consumidores suscetíveis e casos de dermatite de contato alérgica em indivíduos previamente sensibilizados. Ademais, esse trabalho vem contribuir na promoção da inovação e autonomia tecnológica do Brasil dentro da área da Toxicologia do Séc. XXI através do estabelecimento e desenvolvimento de abordagens in vitro de relevância humana para avaliação da sensibilização dérmica.eng
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESeng
dc.formatapplication/pdf*
dc.identifier.citationÁVILA, R. I. Desenvolvimento de plataforma multiparamétrica substitutiva ao uso de animais de laboratório para avaliação do potencial alergênico de misturas da “vida real”. 2018. 119 f. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2018.eng
dc.identifier.urihttp://repositorio.bc.ufg.br/tede/handle/tede/9307
dc.languageporeng
dc.publisherUniversidade Federal de Goiáseng
dc.publisher.countryBrasileng
dc.publisher.departmentFaculdade de Medicina - FM (RG)eng
dc.publisher.initialsUFGeng
dc.publisher.programPrograma de Pós-graduação em Ciências da Saúde (FM)eng
dc.rightsAcesso Aberto
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.subjectAlérgenospor
dc.subjectDermatite alérgica de contatopor
dc.subjectHipersensibilidade tardiapor
dc.subjectRotas de resultados adversospor
dc.subjectSegurança de produtos ao consumidorpor
dc.subjectTécnicas in vitropor
dc.subjectTestes de toxicidadepor
dc.subjectToxicologiapor
dc.subjectAllergenseng
dc.subjectDermatitis, allergic contacteng
dc.subjectHypersensitivity, delayedeng
dc.subjectAdverse outcome pathwayseng
dc.subjectConsumer product safetyeng
dc.subjectIn vitro techniqueseng
dc.subjectToxicity testseng
dc.subjectToxicologyeng
dc.subject.cnpqMEDICINA::ANATOMIA PATOLOGICA E PATOLOGIA CLINICAeng
dc.titleDesenvolvimento de plataforma multiparamétrica substitutiva ao uso de animais de laboratório para avaliação do potencial alergênico de misturas da “vida real”eng
dc.title.alternativeDevelopment of a multiparametric platform to replace the use of laboratory animals for the assessment of the allergenic potential of "real-life" mixtureseng
dc.typeTeseeng

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